一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体及其制备工艺制造技术

本发明专利技术提供一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体及其制备工艺，涉及纳米抗体技术领域；该犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体的制备工艺，包括以下步骤：S1灭活苗免疫双峰驼；S2分离细胞；S3扩增VHH基因及展示载体构建；S4纳米抗体文库的构建以及库容量测定；S5重组噬菌体滴度测定；S6淘选H蛋白特异性重组噬菌体；S7H蛋白特异性重组噬菌体富集；通过将犬瘟热灭活疫苗免疫骆驼后分离其外周血淋巴细胞利用巢氏PCR方法扩增双峰驼的VHH基因，将其连入pCANTAB 5E噬菌体载体，构建噬菌体展示文库，利用噬菌体展示技术经过淘选，共筛选到3株H蛋白特异性纳米抗体，试验证明这些纳米抗体能够与H蛋白特异性反应，具有分子量小、稳定性好、高亲和力的特点。点。点。

【技术实现步骤摘要】
一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体及其制备工艺


[0001]本专利技术涉及纳米抗体
，具体为一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体及其制备工艺。

技术介绍

[0002]犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的犬科、鼬科和浣熊科等动物危害最为严重的传染病之一；犬瘟热是泛嗜性病毒，可以感染很多组织和器官，仅通过临床症状观察和病理变化很难对犬瘟热进行确诊；犬瘟热基因组编码核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质膜蛋白（M）、大蛋白（L）、融合蛋白（F）和血凝蛋白（H）6个蛋白，而H蛋白是犬瘟热感染细胞过程中侵袭宿主所必需的，也是产生中和抗体的主要抗原，同时也是变异最大的结构抗原。
[0003]目前现有的针对犬瘟热结构蛋白的抗体以单克隆抗体和多克隆抗体为主，单克隆抗体分子量大，不易识别隐藏表位，生产成本高。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体及其制备工艺，解决了现有的针对犬瘟热H蛋白的抗体生产成本高，表达系统繁琐复杂等问题。
[0005]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体，所述纳米抗体以H蛋白作为靶标，所述H蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0006]优选的，所述纳米抗体由DNA分子编码制成，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0007]优选的，一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体的制备工艺，包括以下步骤：S1.灭活苗免疫双峰驼将2～3mL犬瘟热灭活疫苗注射于双峰骆驼颈部，注射方式为皮下注射，每次免疫注射间隔期为两周，第五次免疫注射后使用注射器在双峰驼颈部静脉处采集外周血100mL；S2.分离细胞向离心管内加入2～3mL的血液和2～3mL的PBS溶液吹打混匀进行稀释，再取一个新的离心管并向内滴加3～5mL的ficoll分离液，再将稀释后的血液轻缓的滴加至离心管内，使得混合血液层位于ficoll分离液上层，将离心管放入离心机内，以300～500xg的离心加速度进行离心25～40min，离心温度为18～25℃，离心结束后首先吸取离心管内上层的血浆层，再吸取中间的白膜层，白膜层即为淋巴细胞，血浆层为血清；S3.扩增VHH基因及展示载体构建将采集的100mL外周血装入抗凝血采血袋中，并加入相同体积的细胞培养基稀释好的血液，外周血淋巴细胞使用RNA提取试剂盒进行RNA提取，以提取的RNA作为模板，使用巢氏PCR方法进行第一轮扩增，胶回收700～750bp附近的条带，再以cDNA作为模板进行第二步扩增VHH基因，将第二轮PCR产物放入电泳仪内进行电泳，切去400～450bp附近的条带，使
用胶回收试剂盒回收PCR产物，选择Pst I和Not I对酶切位点进行酶切，同时将VHH基因以及载体基因进行酶切处理，酶切16～18h后，使用DNA连接酶将VHH连接至 pCANTAB 5E载体；S4.纳米抗体文库的构建以及库容量测定将S3步骤的连接产物通过电转化至TGI感受态细胞中，转化结束后加入10～13mL预热的SOC培养基置于37～40℃的摇床中以220～250rpm培养1～2h，培养结束后取出50～60μL的菌体均匀涂抹在LB/Amp
‑
GLU固体平板上将固体平板倒置放在培养箱内，以37～40℃的温度培养6～8h，培养结束后用细胞刮铲刮下培养皿上的菌苔，装入有浓度为50%的甘油瓶内，密封保存在
‑
80～
‑
85℃的冷冻设备中，取出1～2mL菌液涂抹在固定平板上，放入培养箱内培养12～14h，计算形状规则的单菌落得到文库库容量，并进行菌液PCR鉴定；S5.重组噬菌体滴度测定在甘油瓶内取出1～2mL的文库菌液放入2
ꢀ×ꢀ
TY/Amp
‑
GLU培养基中，将培养基置于摇床内培养至对数期，以20个MOI加入M13K07辅助噬菌体，培养基37℃静置30～45min，400～500g离心15～30min后去除上层清液，再加入2
ꢀ×
TY/Amp
‑
Kan培养基重悬菌体，220～250r/min的转速培养14～16h，然后再以12000g离心5min后取出上层清液，加入2～4mL的PEG溶液，4℃静置6～8h，12000～13000g离心5～10min后加入1～2mLPBS重悬液；蘸取TG1菌液均匀涂抹与M9平板上，37℃培养40～48h后，挑取单菌落培养至对数期，使用2
ꢀ×ꢀ
TY培养基稀释重组噬菌体，取稀释度为10
‑
9和10
‑
10的样品100～120
ꢀµ
L加入到200～250
ꢀµ
L的 TG1菌液中，在37℃的温度下静置30～45min后，均匀涂抹于LB/Amp
‑
GLU平板上，37℃培养8～10h;S6.淘选H蛋白特异性重组噬菌体将ELISA板内每孔包被10μgH蛋白，对照孔内包被PBS溶液，并加入100μL3%的BSA溶液，在室温条件下封闭1～2h，再使用PBS溶液对板材冲洗4次，将噬菌体稀释至5
×
1011 pfu/ml，洗板结束后加入100～150μL的0.1M的三乙胺，将板材置于通风橱内静置10～15min后，加入100～150μL的1M Tris
‑
HCl进行中和，中和后pH值为7.4，测定洗脱下来的噬菌体滴度，取2～4mL对数生长期的TG1菌液，加入100～120μL的噬菌体溶液混匀，37℃的培养箱内放置30～45min后，立即加入8～10mL的2
×
TY/Amp
‑
GLU培养基，并置于摇床中培养至对数生长期；取40～45μL的M13K07辅助噬菌体加入到培养基内浸染1～2h，再将培养基内液体放入离心机内以1500～1800r/min的转速离心5～10min，离心后使用2
×
YT/AMP
‑
KAN重悬，将锥形瓶放入摇床内培养12～14h，重复上述步骤两次，完成三轮淘选过程；S7.H蛋白特异性重组噬菌体富集取第三轮噬菌体洗脱液100μL，涂抹于培养皿上培养12h，挑取48个菌落置于TB培养基中培养，待到对数生长期时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导过夜表达，12000g离心10～15min后收集菌体，置于
‑
80℃冷冻30min后置于室温裂解菌体释放粗提物，加入500μLPBS溶液12000g/min的转速离心5min后收集上层清液，将ELISA板内每孔包被H蛋白400～450ng，在4～6℃的温度条件下放置8～12h，3%的BSA封闭1～2h；使用PBS
’
T溶液洗涤三次，每孔加入100μL十倍稀释的上层清液，孵育1h，再次洗板三次后加入1：3000稀释的抗M13噬菌体单克隆抗体100μL，在25～30℃下孵育1～1.5h后，使用PBS
’
T洗板3次，加入TMB显色液静置15～20min显色，向每孔内加入50～100μL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体以H蛋白作为靶标，所述H蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体由DNA分子编码制成，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。3.根据权利要求1所述的一种犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体的制备工艺，其特征在于：包括以下步骤：S1.灭活苗免疫双峰驼将2～3mL犬瘟热灭活疫苗注射于双峰骆驼颈部，注射方式为皮下注射，每次免疫注射间隔期为两周，第五次免疫注射后使用注射器在双峰驼颈部静脉处采集外周血100mL；S2.分离细胞向离心管内加入2～3mL的血液和2～3mL的PBS溶液吹打混匀进行稀释，再取一个新的离心管并向内滴加3～5mL的ficoll分离液，再将稀释后的血液轻缓的滴加至离心管内，使得混合血液层位于ficoll分离液上层，将离心管放入离心机内，以300～500g的离心加速度进行离心25～40min，离心温度为18～25℃，离心结束后首先吸取离心管内上层的血浆层，再吸取中间的白膜层，白膜层即为淋巴细胞，血浆层为血清；S3.扩增VHH基因及展示载体构建将采集的100mL外周血装入抗凝血采血袋中，并加入相同体积的细胞培养基稀释好的血液，外周血淋巴细胞使用RNA提取试剂盒进行RNA提取，以提取的RNA作为模板，使用巢氏PCR方法进行第一轮扩增，胶回收700～750bp附近的条带，再以cDNA作为模板进行第二步扩增VHH基因，将第二轮PCR产物放入电泳仪内进行电泳，切去400～450bp附近的条带，使用胶回收试剂盒回收PCR产物，选择Pst I和Not I对酶切位点进行酶切，同时将VHH基因以及载体基因进行酶切处理，酶切16～18h后，使用DNA连接酶将VHH连接至 pCANTAB 5E载体；S4.纳米抗体文库的构建以及库容量测定将S3步骤的连接产物通过电转化至TGI感受态细胞中，转化结束后加入10～13mL预热的SOC培养基置于37～40℃的摇床中以220～250rpm培养1～2h，培养结束后取出50～60μL的菌体均匀涂抹在LB/Amp
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GLU固体平板上将固体平板倒置放在培养箱内，以37～40℃的温度培养6～8h，培养结束后用细胞刮铲刮下培养皿上的菌苔，装入有浓度为50%的甘油瓶内，密封保存在
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85℃的冷冻设备中，取出1～2mL菌液涂抹在固定平板上，放入培养箱内培养12～14h，计算形状规则的单菌落得到文库库容量，并进行菌液PCR鉴定；S5.重组噬菌体滴度测定在甘油瓶内取出1～2mL的文库菌液放入2
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GLU培养基中，将培养基置于摇床内培养至对数期，以20个MOI加入M13K07辅助噬菌体，培养基37℃静置30～45min，400～500g离心15～30min后去除上层清液，再加入2
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Kan培养基重悬菌体，220～250r/min的转速培养1...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱光，王译晨，朱绍辉，肖发沂，齐艳君，王小伟，张彤晨，柏诚昊，
申请(专利权)人：山东畜牧兽医职业学院，
类型：发明
国别省市：