一种多糖、其硫酸化产物及其在制备抗炎药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多糖、其硫酸化产物及其在制备抗炎药物中的应用。本发明专利技术从保藏编号为CCTCC No.M2016542的土壤类芽孢杆菌提取出一种胞外多糖，结构式为：该多糖硫酸化修饰后得到的硫酸化多糖对巨噬细胞炎症反应具有显著的抑制作用，可用于制备抗炎药物。药物。药物。

【技术实现步骤摘要】
一种多糖、其硫酸化产物及其在制备抗炎药物中的应用


[0001]本专利技术属于生物制药
，涉及一种糖、其硫酸化产物及其在制备抗炎药物中的应用。

技术介绍

[0002]炎症是宿主对入侵病原体或组织损伤的有益反应，其主要目的是恢复组织内稳态。炎症在控制和消除感染方面起着重要作用，但是过度的炎性反应可能导致进一步的组织损伤，并引起慢性炎症性疾病和自身免疫病，最终导致器官功能丧失。在炎症过程中，单核细胞/巨噬细胞是参与体内炎性反应的主要功能细胞。M1型单核细胞/巨噬细胞受微环境中生物物质(如细胞因子、微生物、微生物代谢产物和其他调节剂)诱导，产生多种促炎性介质，包括诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子TNF
‑
α、IL
‑
1β、IL
‑
6、IL
‑
12和蛋白水解酶，构成对病原体的第一道防线。在炎症后期若促炎性M1型和抑炎性M2型巨噬细胞调节失衡，极易造成炎性反应持续，进而产生组织损伤和慢性炎症的发生。因此，寻找合适方法适度抑制巨噬细胞炎症反应有助于对炎症性疾病的治疗。
[0003]常用的抗炎治疗包括降低或中和促炎介质水平和/或抑制白细胞募集及其激活的策略。这些疗法包括非甾体抗炎药(NSAID)、糖皮质激素(GC)受体激动剂(合成GCs)和针对特定促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子(TNF)
‑
α和白细胞介素(IL)
‑
1)的抗体或抑制剂。除了化学合成的抗炎药物(如地塞米松)以外，天然产物(如多糖)及其衍生物在抑制巨噬细胞炎症反应中也具有一定效果。天然产物及其衍生物由于生产和纯化工艺较为简单，能够实现较大规模生产，具有潜在的成本优势和良好的应用潜力。
[0004]许多土壤类芽孢杆菌(Paenibacillusedaphicus)菌株具有合成胞外多糖的能力，胞外多糖组成通常由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、鼠李糖以及葡萄糖醛酸中的几种或者全部组成，但是不同菌株所产多糖糖链的化学组成和结构以及性能均存在明显差别。中国专利106399199B公开了一种保藏编号为CCTCC No.M2016542的土壤类芽孢杆菌，并发现其产生的一种胞外多糖能够调节水溶液的流变性质，具有显著的增加溶液粘度的作用，能够耐受溶液中高浓度的Na
+
、K
+
、Ca
2+
和Mg
2+
，经过简单的加热冷却处理即可使溶液粘度数倍增加，且性质稳定，形成热可逆凝胶。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供由保藏编号为CCTCC No.M2016542的土壤类芽孢杆菌产生的一种多糖。
[0006]本专利技术所述的保藏编号为CCTCC No.M2016542的土壤类芽孢杆菌已在中国专利106399199B充分公开。
[0007]本专利技术所述的多糖，其结构式为：
[0008][0009]其中，R1＝H或COCH3，重复单元数量(n)＝5～500。
[0010]本专利技术的目的之二在于提供上述多糖的制备方法，具体步骤如下：
[0011]步骤1，将保藏编号为CCTCC No.M2016542的土壤类芽孢杆菌接种至发酵培养基中摇床震荡培养，获得含有胞外多糖的发酵液；
[0012]步骤2，在发酵液中加入乙醇，沉淀经过滤、干燥后得到固体粗多糖；
[0013]步骤3，将粗多糖重新溶解于去离子水中，经过离心除去不溶性杂质，加入氯仿与正丁醇体积比为4:1的氯仿/正丁醇溶液，除去蛋白质，再依次通过阴离子交换层析和NaCl溶液梯度洗脱，并透析脱盐，收集多糖组分，最后干燥得到纯化后的固体多糖。
[0014]优选地，步骤2中，乙醇的加入量为发酵液体积的2～4倍。
[0015]优选地，步骤3中，阴离子交换层析填料为强阴离子交换树脂或弱阴离子交换树脂，更优选为强阴离子交换树脂。
[0016]优选地，NaCl溶液梯度范围为0～1mol/L。
[0017]本专利技术的目的之三在于提供一种上述多糖的硫酸化产物，即一种硫酸化多糖，其结构式为：
[0018][0019]其中，R2＝H或SO3H，R3＝H或COCH3或SO3H，且R3＝H或COCH3时，R2不全为H。
[0020]优选地，硫酸化多糖的硫酸化取代度为0.5～2.0。
[0021]本专利技术的目的之四在于提供上述硫酸化多糖的制备方法，具体步骤如下：
[0022]将多糖溶于甲酰胺中，与吡啶
‑
氯磺酸混合，50℃～85℃下加热反应，反应结束后，加入氢氧化钠溶液终止反应，依次经离心、透析、有机溶剂沉淀、干燥，制得固体硫酸化多糖。
[0023]优选地，氯磺酸与多糖中单糖单元的摩尔比为10：1～50：1，吡啶与多糖中单糖单元的摩尔比为20：1～120：1。
[0024]优选地，反应时间为0.5～5h，更优选为1～3h。
[0025]优选地，反应温度为50℃～65℃。
[0026]优选地，有机溶剂为乙醇、异丙醇或丙酮。
[0027]本专利技术的目的之五在于提供上述硫酸化多糖在制备抑制巨噬细胞炎症反应药物
中的应用。
[0028]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0029](1)本专利技术的多糖由土壤类芽孢杆菌发酵获得，发酵工艺简单，多糖回收和纯化方法成熟，质量可控；
[0030](2)本专利技术的硫酸化多糖在较大浓度范围内对巨噬细胞增殖无毒害作用，且在较低浓度时即可以显著降低由脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞胞内多种促炎介质的表达水平，显示出良好的炎症抑制活性；
[0031](3)本专利技术的硫酸化多糖生产工艺简单，收率高，炎症抑制活性高，具有良好的应用前景。
附图说明
[0032]图1为本专利技术的多糖和硫酸化多糖红外吸收光谱比较图。
[0033]图2为本专利技术的多糖在气相色谱质谱(GC
‑
MS)分析中的总离子流图。
[0034]图3为本专利技术的多糖在核磁共振分析中的1H、
13
C和DEPT
‑
135谱图。
[0035]图4为本专利技术的多糖在核磁共振分析中的COSY和TOCSY谱图。
[0036]图5为本专利技术的多糖在核磁共振分析中的HSQC谱图。
[0037]图6为本专利技术的多糖在核磁共振分析中的HMBC谱图。
[0038]图7为小鼠巨噬细胞RAW264.7在含有不同浓度硫酸化多糖时的存活率曲线。
[0039]图8为不同浓度硫酸化多糖抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO、细胞内TNF
‑
α和NF
‑
κB转录水平的结果图。
[0040]图9为不同浓度硫酸化多糖和地塞米松抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO、细胞内TNF
‑
α和NF
‑
κB转录水平的结果图。
具体实施方式<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多糖，其结构式为：其中，R1＝H或COCH3，n＝5～500。2.根据权利要求1所述的多糖的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，将保藏编号为CCTCC No.M2016542的土壤类芽孢杆菌接种至发酵培养基中摇床震荡培养，获得含有胞外多糖的发酵液；步骤2，在发酵液中加入乙醇，沉淀经过滤、干燥后得到固体粗多糖；步骤3，将粗多糖重新溶解于去离子水中，经过离心除去不溶性杂质，加入氯仿与正丁醇体积比为4:1的氯仿/正丁醇溶液，除去蛋白质，再依次通过阴离子交换层析和NaCl溶液梯度洗脱，并透析脱盐，收集多糖组分，最后干燥得到纯化后的固体多糖。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，乙醇的加入量为发酵液体积的2～4倍；步骤3中，阴离子交换层析填料为强阴离子交换树脂或弱阴离子交换树脂，NaCl溶液梯度范围为0～1mol/L。4.一种硫酸化多糖，其结构式为：其中，R2＝H或SO3H，R3＝H或CO...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晶，张会娟，张建法，王世明，程瑞，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：