一种敲除MIC3基因的重组球虫载体及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种敲除MIC3基因的重组球虫载体及其检测方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术提供一种靶向球虫MIC3基因的sgRNA，所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA的靶点位于MIC3基因；由sgRNA、Cas9和同源重组质粒建立基因编辑系统，可精确地敲除球虫MIC3基因并同源重组荧光标记蛋白于MIC3基因，构建一种表达荧光标记蛋白的重组球虫载体。所述重组球虫载体的DNA经过PCR检测和测序，表明荧光标记基因已成功重组于MIC3基因，且重组球虫载体在荧光显微镜下具有明显的荧光信号，表明其已成功敲除MIC3基因并表达荧光标记蛋白。基因并表达荧光标记蛋白。基因并表达荧光标记蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种敲除MIC3基因的重组球虫载体及其检测方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种敲除MIC3基因的重组球虫载体及其检测方法。

技术介绍

[0002]微线体蛋白(Microneme protein，MIC)是由微线体分泌的蛋白，具有识别、粘附与侵染宿主细胞的功能。细胞内游离钙水平的升高可以引起微线体蛋白的分泌(Carruthers and Sibley，1999)，当柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)子孢子暴露于白蛋白时也可因受到刺激而合成MIC蛋白(Bumstead and Tomley，2000)，当裂殖子与宿主细胞接触时也可产生(Carruthers and Sibley,1997)。
[0003]微线体蛋白从微线体顶端释放出来，并向后覆盖在子孢子上，这些蛋白质在运动和侵袭中起着至关重要的作用，很可能介导寄生虫和宿主细胞表面之间的粘附，并促进寄生虫肌动蛋白骨架的产生。柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白3(EtMIC3)最早由Tomley等人克隆并测序，序列分析结果显示EtMIC3与TgMIC1的相似性较高。Labbe等人运用两种不同的从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊阶段制备的单克隆抗体，从子孢子cDNA表达文库中筛选出EtMIC3并克隆，结果显示EtMIC3表达于子孢子的顶端，在胞内寄生的早期检测不到EtMIC3的表达，但是在成熟的裂殖体内可以检测到；两种针对不同EtMIC3基序的单克隆抗体对球虫的阻断作用各不相同，一种抑制艾美耳球虫对宿主细胞的入侵，另外一种阻碍球虫入侵后在宿主细胞内的发育；这一系列表达和定位实验表明EtMIC3在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主过程中发挥关键作用(Labbe，2005)。
[0004]目前，关于MIC3蛋白与球虫感染之间的作用机理并不明确。如何提供一种球虫的MIC蛋白模型，为相关的研究工作奠定基础，已成为亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种敲除MIC3基因的重组球虫载体及其检测方法，所述靶向MIC3基因的sgRNA具有良好的特异性与靶向性，利用其制备的重组球虫载体稳定表达荧光，可应用于相关的研究及疫苗的制备中。
[0006]为达此目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种靶向球虫MIC3基因的sgRNA，所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA的靶点位于MIC3基因。
[0008]优选地，所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA包括SEQ ID NO.1～2所示的核苷酸序列中的任意一种。
[0009]SEQ ID NO.1：tacgaccccgcctactcctacgg；
[0010]SEQ ID NO.2：tattcgaaaatactgctggtggg。
[0011]本专利技术中，所述靶向MIC3基因的sgRNA位于MIC3基因编码区的内部，可配合Cas9以及同源重组质粒实现MIC3基因的敲除以及外源基因的定点插入，基因编辑效率高，脱靶率
低，且避免了外源片段的随机插入。
[0012]第二方面，本专利技术提供了一种球虫MIC3基因编辑系统，所述球虫MIC3基因编辑系统包括第一方面所述的靶向球虫MIC3基因的sgRNA。
[0013]优选地，所述球虫MIC3基因编辑系统还包括Cas9。
[0014]优选地，所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA与所述Cas9连接在同一个基因编辑质粒中。
[0015]本专利技术中，CRISPR
‑
Cas9基因编辑系统由规律成簇间隔短回文重复序列以及CRISPR相关蛋白9组成，是继锌指核酸酶和转录激活因子效应物核酸酶技术之后迅速发展起来的基因组编辑技术，在细胞基因敲除中已被广泛应用。
[0016]CRISPR
‑
Cas9通过小导向RNA识别靶向序列并引导Cas9蛋白对靶位点进行切割，使DNA发生双链断裂。断裂的DNA为防止降解会自动启动内源性修复机制，通常有两种：在非同源末端连接修复机制下修复时并不是非常精确，在断裂缺口处往往随机插入或删除碱基，若突变位点位于蛋白编码区，将转录错误的mRNA，导致翻译失败或蛋白失活从而实现基因敲除；在同源重组修复机制以及修复模板存在的条件下，也可以实现定点的单个碱基或者长片段的插入、删除或者突变，实现基因的敲入与敲除。
[0017]优选地，所述MIC3基因编辑系统还包括同源重组质粒。
[0018]优选地，所述同源重组质粒中包括筛选标记基因。
[0019]优选地，所述筛选标记基因包括荧光标记基因。
[0020]优选地，所述同源重组质粒还包括5
’
同源臂、启动子和3
’
同源臂。
[0021]本专利技术中，5
’
同源臂和3
’
同源臂为同源重组修复提供了模板，提高了同源重组的效率。
[0022]本专利技术中，通过靶向球虫MIC3基因的sgRNA、Cas9与同源重组质粒的相互配合，实现了在球虫MIC3基因内部定点插入筛选标记基因，避免了外源片段随机插入的不可控性，插入效率更高。
[0023]第三方面，本专利技术提供了一种敲除球虫MIC3基因的重组球虫载体，所述重组球虫载体含有第一方面所述的靶向球虫MIC3基因的sgRNA。
[0024]本专利技术中，所述球虫包括柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫或早熟艾美耳球虫中的任意一种。
[0025]优选地，所述重组球虫载体含有第二方面所述的球虫MIC3基因编辑系统。
[0026]优选地，所述重组球虫载体为经过第二方面所述的球虫MIC3基因编辑系统编辑后，在MIC3基因中插入了筛选标记基因的球虫载体。
[0027]本专利技术中，所述重组球虫载体敲除了MIC3基因，且稳定表达荧光蛋白，可用于球虫生长、基因功能研究、球虫与宿主的作用机制以及疫苗制备等相关的研究中。
[0028]第四方面，本专利技术提供了一种第三方面所述的重组球虫载体的构建方法，所述构建方法包括：
[0029]构建基因编辑质粒；
[0030]构建同源重组质粒；
[0031]将所述基因编辑质粒和所述同源重组质粒导入球虫子孢子中，筛选阳性克隆，得到所述重组球虫载体。
[0032]本专利技术中，所述重组球虫的构建方法容易操作，技术成熟，为相关产品的制备与推广创造了条件。
[0033]优选地，所述基因编辑质粒的构建方法包括：
[0034]PCR扩增所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA和Cas9的编码序列，连接，得到含有靶向球虫MIC3基因的sgRNA与Cas9的基因编辑质粒。
[0035]优选地，所述同源重组质粒的构建方法包括：
[0036]依次将5
’
同源臂、启动子、荧光标记基因和3
’
同源臂按顺序连接，再连接到克隆载体上，得到含有荧光标记基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向球虫MIC3基因的sgRNA，其特征在于，所述靶向球虫MIC3基因的sgRNA的靶点位于MIC3基因。2.一种球虫MIC3基因编辑系统，其特征在于，所述球虫MIC3基因编辑系统包括权利要求1所述的靶向球虫MIC3基因的sgRNA。3.根据权利要求2所述的球虫MIC3基因编辑系统，其特征在于，所述球虫MIC3基因编辑系统还包括Cas9。4.根据权利要求2所述的球虫MIC3基因编辑系统，其特征在于，所述球虫MIC3基因编辑系统还包括同源重组质粒。5.根据权利要求4所述的球虫MIC3基因编辑系统，其特征在于，所述同源重组质粒中包括筛选标记基因；优选地，所述筛选标记基因包括荧光标记基因。6.一种敲除球虫MIC3基因的重组球虫载体，其特征在于，所述重组球虫载体含有权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：林瑞庆，方园婷，周德荣，翁亚彪，陆肖，蔡晓懿，孟甜，王瑞珍，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：