一种碳青霉烯酶保守抗原、抗体及其应用制造技术

本发明专利技术创造提供了一种碳青霉烯酶保守抗原、抗体及其应用，所述保守抗原包含具有如SEQ ID NO：1～15中的任意一条或几条所示的氨基酸序列。本发明专利技术使用的抗原为碳青霉烯酶保守抗原，在常见亚型中均存在的氨基酸片段，用其免疫动物获得的单克隆抗体或多克隆抗体对常见亚型均有识别，出现假阴性的概率极低。出现假阴性的概率极低。出现假阴性的概率极低。

【技术实现步骤摘要】
一种碳青霉烯酶保守抗原、抗体及其应用


[0001]本专利技术创造属于试剂盒制备领域，尤其是涉及一种碳青霉烯酶保守抗原、抗体及其应用。

技术介绍

[0002]当前，细菌耐药已成为全球公共健康领域的重大挑战，其中尤以碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（carbapenem
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resistant Enterobacterales， CRE）引起的感染形势最为严峻。碳青霉烯类抗菌药物包括亚胺培南、美罗培南和厄他培南等，是治疗多重耐药革兰阴性杆菌所致感染最有效的抗菌药物之一。而随着该类药物在临床的广泛应用，肠杆菌目细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率呈逐年快速上升趋势。CHINET中国细菌耐药监测网历年监测结果显示，我国临床分离肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率从2005年的3%快速攀升至2019年的25%以上，上升幅度高达8倍。2018年全国细菌耐药监测网（CARSS）数据显示，全国1429所医院临床分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的平均耐药率为10.1%，部分省市甚至超过20% 。由于CRE菌株通常还携带有对其他抗菌药物耐药的基因，对抗菌药物呈广泛耐药甚至全耐药的特征，使临床的抗感染治疗面临无药可用的困境。
[0003]产生碳青霉烯酶是肠杆菌目细菌对碳青霉烯类药物耐药最主要的机制。
[0004]碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南的一类β
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2内酰胺酶，包括Ambler分子分类的A、B、D 三类酶。
[0005]不同国家、不同地区、不同医院、不同人群以及不同细菌所产的碳青霉烯酶种类均有差异。我国临床分离的CRE菌株产生的碳青霉烯酶以KPC和NDM型为主，少数菌株产生OXA
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48、IMP和VIM型碳青霉烯酶。KPC
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2型酶为KPC型碳青霉烯酶最主要的亚型，NDM
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1和NDM
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5是NDM型金属酶中最主要的亚型，而OXA
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181和OXA
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232型酶是OXA
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48型碳青霉烯酶中最主要的亚型。CHINET中国细菌耐药监测网对2018年收集自全国39所医院935株CRE菌株的研究结果显示，产KPC、NDM和OXA
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48型碳青霉烯酶菌株所占比例分别为51.6%（482/935）、35.7%（334/935）和7.3%（68/935），其中少数菌株产碳青霉烯酶复合酶。
[0006]由于不同种类的抗菌药物对产生不同碳青霉烯酶菌株的体外抗菌活性不同，准确、快速地对CRE产生的碳青霉烯酶进行检测并分型，对于临床抗感染治疗的精准用药和医院感染预防控制具有重要的价值。
[0007]目前实验室检测碳青霉烯酶的方法分为表型检测和基因型检测。表型检测方法包括Carba NP试验、改良碳青霉烯灭活试验（包括mCIM和eCIM）、碳青霉烯酶抑制剂增强试验和时间飞行质谱技术等，表型检测耗时较长且对实验人员有较高要求，大部分方法需过夜培养待测菌株，Carba NP试验、mCIM和eCIM试验还存在假阴性的风险；基因型检测方法主要是基因检测技术，而该技术对设备和人员培训的要求较高，检测时间一般。相比而言，胶体金技术检测方法的检测时间短（约20min左右），人员培训要求低，对设备无需求。
[0008]而对于胶体金平台，广谱抗体的筛选及配对是一大技术难题。因为如果用单一亚型的重组完整抗原去免疫动物，有可能获得仅针对该亚型表位的抗体，而用这些抗体去检
测时会出现部分亚型漏检的假阴性情况；另外使用单一亚型的重组完整抗原进行动物免疫也会产生大量的针对单一表位或邻近表位的抗体，这类抗体因存在空间位阻而无法配对，给配对抗体的筛选带来很大的困难。为了方便客户同时进行5种碳青霉烯酶（KPC、NDM、OXA
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48、VIM和IMP）的检测，最好将这5种碳青霉烯酶检测放在同一检测卡上，需要根据不同种碳青霉烯酶抗体是否存在交叉或干扰的特点来进行的排列组合，从而来制备胶体金检测卡。另外，高效裂解液的开发也是影响检测试剂灵敏度的一个重要因素，裂解液的组分对层析试剂的影响需要进行验证，需要筛选不影响层析试剂同时裂解效果好的组分来配制并优化组成。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本专利技术创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种碳青霉烯酶保守抗原、抗体及其应用。
[0010]为达到上述目的，本专利技术提供一种碳青霉烯酶保守抗原，所述保守抗原为具有氨基酸序列如SEQ ID NO：1～15中的任意一条或几条所示，或者具有经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列。
[0011]本专利技术还提供一种碳青霉烯酶的广谱特异性抗体，所述广谱特异性抗体为由上述保守抗原制备得到的单克隆抗体或多克隆抗体。
[0012]本专利技术还提供一种碳青霉烯酶检测试剂，所述检测试剂包括革兰氏阴性细菌裂解液以及上述保守抗原或上述广谱特异性抗体。
[0013]优选的，所述革兰氏阴性细菌裂解液的有效成分为：月桂酰肌胺酸钠、CHAPS、SDS中的一种或几种的混合物。
[0014]优选的，所述革兰氏阴性细菌裂解液中月桂酰肌胺酸钠的质量0.1%~1%。
[0015]优选的，所述革兰氏阴性细菌裂解液中CHAPS 的质量百分比为0.01%~0.1%。
[0016]优选的，所述革兰氏阴性细菌裂解液中SDS的质量百分比为0.1%~1%。
[0017]优选的，所述革兰氏阴性细菌裂解液包含质量百分比为0.2%的月桂酰基氨酸钠、0.02% 的CHAPS和0.1%的 SDS。
[0018]本专利技术还提供一种碳青霉烯酶检测试剂盒，所述试剂盒包含上述碳青霉烯酶检测试剂。
[0019]优选的，所述碳青霉烯酶检测试剂盒为胶体金检测试剂盒，所述试剂盒中的抗体标记物为胶体金。
[0020]相对于现有技术，本专利技术创造具有以下优势：（1）本专利技术使用的抗原为碳青霉烯酶保守抗原，在常见亚型中均存在的氨基酸片段，用其免疫动物获得的单克隆抗体或多克隆抗体对常见亚型均有识别，出现假阴性的概率极低。
[0021]（2）本专利技术使用的革兰氏阴性细菌裂解液，该裂解液对检测抗体和层析效果影响小，操作简单时间短，无需设备，且裂解效果可达到物理破碎方法的90%以上。
附图说明
[0022]图1为本专利技术实施例1制得的碳青霉烯酶的SDS
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PAGE电泳图；
图2为本专利技术实施例2制得的碳青霉烯酶单克隆抗体SDS
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PAGE电泳图；图3为本专利技术试验例2中试验组1
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6以及对照组的镜检图图4为本专利技术试验例2中对照组与实验组的镜检图。
具体实施方式
[0023]除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种碳青霉烯酶保守抗原，其特征在于：所述保守抗原包含具有如SEQ ID NO：1～15中的任意一条或几条所示的氨基酸序列。2.一种碳青霉烯酶的广谱特异性抗体，其特征在于：所述广谱特异性抗体为由权利要求1所述的保守抗原制备得到的单克隆抗体或多克隆抗体。3.一种碳青霉烯酶检测试剂，其特征在于：所述检测试剂包括革兰氏阴性细菌裂解液以及权利要求1所述的保守抗原或权利要求2所述的广谱特异性抗体。4.根据权利要求3所述的碳青霉烯酶检测试剂，其特征在于：所述革兰氏阴性细菌裂解液的有效成分为：月桂酰肌胺酸钠、CHAPS、SDS中的一种或几种的混合物。5.根据权利要求4所述的碳青霉烯酶检测试剂，其特征在于：所述革兰氏阴性细菌裂解液中月桂酰肌胺酸钠的质量百分比为0.1%~1%。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张舟，严俊，果馨儒，杨光，付成华，盛长忠，粟艳，周泽奇，
申请(专利权)人：丹娜天津生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：