突变的蛋白A结构域C及其应用制造技术

本发明专利技术涉及突变的蛋白A结构域C及其应用。具体而言，本发明专利技术提供一种分离的多肽，与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比，该多肽在选自第3位、第6位、第9位和第15位的一个或多个位置上具有如文中所述的取代突变。本发明专利技术还提供含有所述多肽的融合蛋白、重组蛋白A，相应的编码序列、核酸构建物、表达系统、分离基质、方法及用途。本发明专利技术的分离多肽相对于天然C结构域，在碱清洗过程中具有明显提升的碱性稳定性。定性。

【技术实现步骤摘要】
突变的蛋白A结构域C及其应用


[0001]本专利技术涉及突变的蛋白A结构域C及其应用。

技术介绍

[0002]近年来抗体药物以其高特异性成为全球药品市场上炙手可热的药品，而单克隆抗体是生物制药产业增长最快的领域之一。单克隆抗体具有三种独特的作用机制，分别为靶向效应、阻断效应和信号传导效应，单克隆抗体药物主要用来治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等，尤其是在癌症治疗方面的疗效突出。
[0003]当前，抗体药的纯化主要依托亲和介质配基蛋白A(Protein A)上的多个区域对抗体Fc独特段的特殊的吸附能力实现抗体的捕捉得以实现，目前该方法也是工艺技术最为成熟，运用最广泛的一种亲和层析方式。
[0004]然而，Protein A亲和层析介质在抗体的纯化过程中会出现Protein A配基脱落。脱落的配基需要在工艺中除去，避免引起药物免疫反应。而配基的脱落率很大程度上取决于配基的氨基酸分布及稳定性，配基的偶联方式。同时，一般由于经济制约，层析介质会被反复使用，因此需要清洗工序使载体恢复到使用前的状态，通常可使用0.1
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0.5M标准NaOH溶液(CIP)清洗，可以达到高效除去层析介质内的蛋白沉淀物、疏水性蛋白、核酸、内毒素和病毒等。然而，在使用碱性溶液清洗的同时，载体也会暴露在碱性的条件下，对于许多含有蛋白质亲和配体的层析介质的来说，这样的环境是非常严苛的，会导致配基的氨基酸遭到破坏，介质的吸附能力和使用年限也会受到影响。
[0005]因此如何突破Protein A亲和层析介质在碱性环境下的不稳定这一瓶颈，使其在生物亲和层析领域大规模运用，已经成为当前重点需要突破解决的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供与天然蛋白A的C结构域相比碱性稳定性提高的该C结构域的突变体多肽。
[0007]具体而言，本专利技术提供一种多肽，与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比，该多肽在选自第3位、第6位、第9位和第15位的一个或多个位置上具有取代突变。
[0008]在一个或多个实施方案中，与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比，该多肽在第3位、第6位、第9位或第15位具有取代突变；在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比，该多肽在第3位和第6位，或在第3位和第9位，或在第3位和第15位，或在第6位和第9位，或在第6位和第15位，或在第9位和第15位具有取代突变；在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比，该多肽在第3位、第6位和第9位，或在第3位、第6位和第15位，或在第6位、第9位和第15位具有取代突变；在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比，该多肽在第3位、第6位和、第9位以及第15位上具有取代突变。
[0009]在一个或多个实施方案中，与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述
多肽在第15位具有取代突变，并任选地在选自第3位、第6位和第9位的一个或多个位置上具有取代突变。
[0010]在一个或多个实施方案中，与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽在第9位和第15位具有取代突变，并任选地在选自第3位和第6位的任意一个或全部两个位置上具有取代突变。
[0011]在一个或多个实施方案中，与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽在第3位、第9位和第15位具有取代突变，并任选地在第6位上具有取代突变。
[0012]在一个或多个实施方案中，所述第3位上的取代突变为N3L、N3V或N3Y。
[0013]在一个或多个实施方案中，所述第6位上的取代突变为N6S、N6L或N6E。
[0014]在一个或多个实施方案中，所述第9位上的取代突变为Q9I、Q9F或Q9M。
[0015]在一个或多个实施方案中，所述第15位上的取代突变为E15T、E15W、E15L、E15V、E15I、E15F、E15S、E15Y或E15T。
[0016]在一个或多个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2
‑
73中任一所示。
[0017]在一个或多个实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比在29位上的氨基酸残基为A。
[0018]本专利技术第二方面提供一种多肽，所述多肽由以下(i)、(ii)和(iii)组成：(i)本专利技术第一方面任一实施方案所述的多肽，(ii)在(i)所述多肽的氨基酸序列的C端或N端的一个或多个偶联元件，和任选的(iii)来自被切下的信号转导序列的残基。
[0019]在一个或多个实施方案中，所述偶联元件选自：半胱氨酸残基、多个赖氨酸残基和多个组氨酸残基。
[0020]本专利技术第三方面提供一种融合蛋白，该融合蛋白由2
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8条多肽融合形成，其中，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比，在选自第3位、第6位、第9位和第15位的一个或多个位置上具有取代突变。
[0021]在一个或多个实施方案中，所述多肽为本专利技术第一方面任一实施方案所述的多肽。
[0022]在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，所述2
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8条多肽互不相同、部分相同或完全相同。
[0023]在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白所含的每一条所述多肽至少含有E15T、E15W、E15L、E15V、E15I、E15F、E15S、E15Y或E15T突变，优选还含有本文所述第3位、第6位和第15位中的一个或多个位置上的取代突变，优选第3位上的取代突变为N3L或N3V，优选第6位上的取代突变为N3L或N3V，优选第9位上的取代突变为Q9I或Q9F。
[0024]在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，所述多肽选自：SEQ ID NO:2、3、6、7、8、9、11
‑
19、21
‑
25、58
‑
62和65
‑
69。
[0025]在一个或多个实施方案中，所述多肽之间存在或不存在接头序列。
[0026]在一个或多个实施方案中，所述接头序列为含有甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的接头序列。
[0027]在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白的C端或N端还包括一个或多个偶联元件。
[0028]在一个或多个实施方案中，所述偶联元件选自：半胱氨酸残基、多个赖氨酸残基和多个组氨酸残基。
[0029]在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白还包括来自被切下的信号转导序列的残基。
[0030]在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:75
‑
108中任一所示。
[0031]本专利技术第四方面提供一种重组蛋白A，该重组蛋白A的C结构域为本专利技术第一方面任一实施方案所述的多肽。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽选自：(1)与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比，该多肽在选自第3位、第6位、第9位和第15位的一个或多个位置上具有取代突变；其中，第3位的取代突变为天冬酰胺被取代为甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸、缬氨酸或酪氨酸；第6位上的取代突变为天冬酰胺被取代为甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸、谷氨酸或酪氨酸；第9位上的取代突变为谷氨酰胺被取代为甘氨酸、酪氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸；第15位上的取代突变为谷氨酸被取代为甘氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、天冬氨酸或精氨酸；(2)与(1)所述的多肽具有至少85％序列相同性并保留了所述的第3、6、9和15的取代突变的多肽。2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第3位上的取代突变为天冬酰胺被取代为亮氨酸、缬氨酸或酪氨酸；所述第6位上的取代突变为天冬酰胺被取代为丝氨酸、亮氨酸或谷氨酸；所述第9位上的取代突变为谷氨酰胺被取代为异亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸；所述第15位上的取代突变为谷氨酸被取代为苏氨酸、色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸或天冬氨酸。3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述第3位上的取代突变为天冬酰胺被取代为亮氨酸或缬氨酸；所述第6位上的取代突变为天冬酰胺被取代为亮氨酸或谷氨酸；所述第9位上的取代突变为谷氨酰胺被取代为异亮氨酸或苯丙氨酸；所述第15位上的取代突变为谷氨酸被取代为色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸。4.如权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽在第15位具有所述取代突变，并任选地在选自第3位、第6位和第9位的一个或多个位置上具有所述取代突变；或与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽在第9位和第15位具有所述取代突变，并任选地在选自第3位和第6位的任意一个或全部两个位置上具有所述取代突变；或与SEQ ID NO:1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽在第3位、第9位和第15位具有所述取代突变，并任选地在第6位上具有所述取代突变。5.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2
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73中任一所示。6.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽由以下(i)、(ii)和(iii)组成：(i)权利要求1
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5中任一项所述的多肽，(ii)在(i)所述多肽的氨基酸序列的C端或N端的一个或多个偶联元件，和任选的(iii)来自被切下的信号转导序列的残基。7.如权利要求6所述的多肽，其特征在于，所述偶联元件选自：半胱氨酸残基、多个赖氨酸残基和多个组氨酸残基；所述被切下的信号转导序列的残基为AQ。8.一种融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白包含由2
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8条权利要求1
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5中任一项所述的多肽融合形成的氨基酸序列，其中，所述2
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8条多肽互不相同、部分相同或完全相同，且所述
多肽之间任选地存在接头序列。9.如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白所含的每一条所述多肽至少含有E15T、E15W、E15L、E15V、E15I、E15F、E15S、E15Y或E15T突变，优选每一条多肽各自还在第3位、第6位和第9位中的一个或多个位置上具有取代突变；优选地第3位上的取代突变为N3L或N3V；优选地，第6位上的取代突变为N6L或N6E；优选地，第9位上的取代突变为Q9I或Q9F。10.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪，林建光，刘鹏飞，刘星宇，王晓慧，
申请(专利权)人：博格隆浙江生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：