一种葡萄球菌蛋白A、纯化制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种葡萄球菌蛋白A、纯化制备方法及其应用，本发明专利技术主要涉及通过基因工程改造的蛋白ProteinA基因连入表达载体来构建重组质粒，导入原核宿主细胞中进行表达，经Ni亲和和离子交换层析纯化，可获得纯度大于95％的目的蛋白。本发明专利技术纯化制备方法具有纯化工艺简便、收率高等特点。同时制备的ProteinA具有良好的免疫球蛋白IgG结合力、耐碱性和热稳定性。并且固相载体偶联ProteinA制备的亲和介质具有吸附IgG效果佳、载样量高和耐碱性的优点。本发明专利技术制备的ProteinA蛋白及其偶联制备的介质在单克隆抗体纯化领域和免疫诊断研究上均能起到重要的作用。能起到重要的作用。能起到重要的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄球菌蛋白A、纯化制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程中克隆改造ProteinA的
，具体涉及一种葡萄球菌蛋白A、纯化制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]20世纪中期，Jensen发现有一种蛋白可以与人和兔血清抗体广泛结合，该蛋白于1964年首次被称为Protein A。Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，分子量42KDa，它能够特异性地结合多种免疫球蛋白的Fc区段而与Fab区或轻链结合很弱。天然的ProteinA有5个IgG结合结构域E、D、A、B、C和未知功能的非Fc结合域，5个不同的结构域可以结合IgG的Fc片段，具有很强的特异性亲和力，每个ProteinA分子至少可以结合两个IgG分子。同时，IgA、IgM或者IgE也有可能和ProteinA结合。此结构的蛋白A大量结合IgG的同时，其非Fc结合域能结合部分杂蛋白，导致洗脱下来的IgG纯度不够，通常工业合成的抗体经过一步蛋白A亲和层析后样品纯度可超过90％。但对于单克隆抗体来说，这个纯度往往是不够的。因此选择基因工程的方法克隆ProteinA的基因并进行改造，得到重组型蛋白A，加强特异性结合能力，降低非特异性结合，提高耐碱能力及其他性质，是获得优良性质蛋白A制备亲和层析介质的重要途径。
[0003]随着一批批单克隆抗体的获批上市，FDA获批中86％的在单克隆抗体的捕获步骤使用蛋白A，在纯化工艺中主要利用了ProteinA层析作为捕获步骤，自从1978年起，蛋白A的产率和载量已分别以每年4.3％和5.5％的速率增长。正是因为蛋白A的特异性吸附能力，在纯化单克隆抗体中体现着数量级的优势，随着单克隆抗体工业化推进的背景下，蛋白A市场巨大。
[0004]蛋白A对NaOH的耐受性特别重要，是合成高性能蛋白A亲和层析介质的重要评价指标，主要原因：
[0005]1)大规模应用所需：细菌的失活以及热原的去除和防腐剂管理是大规模纯化的重要问题，以确保没有携带和避免不同分离的蛋白质的交叉污染。
[0006]2)CIP(cleaning
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in
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place)所需：NaOH为首选的清洗剂，具有多种优势。能有效溶解脂质、蛋白质和核酸；且从色谱基质中解吸结合物；能够有效的灭活微生物、破坏内毒素；而且，价格便宜，易于监测和清除；
[0007]综上所述，本专利技术依据当前的研究背景，针对ProteinA作为工业化单克隆抗体纯化的关键步骤，同时ProteinA也存在于免疫筛查、免疫诊断等方面的广泛应用，通过基因工程等技术改造获得性能更优，同时符合工业化实际应用需求的ProteinA蛋白，是当前迫切需要的。

技术实现思路

[0008]本专利技术所要解决的问题是：提供一种葡萄球菌蛋白A、纯化制备方法及其应用，本方法通过基因克隆改造设计于原核体系表达的ProteinA蛋白，产量高，且纯化制备工艺简
单、高效、成本低。制备获得的ProteinA蛋白具有耐碱性高、热稳定性强、储存性良好及特异性吸附IgG能力强等优势，与固相载体偶联获得的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率高等优点。
[0009]本专利技术为解决上述问题所提供的技术方案为：
[0010]一种葡萄球菌蛋白A，所述葡萄球菌蛋白A的B功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
[0011]本专利技术还公开了一种葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法，所述方法包括
[0012]将来源于葡萄球菌的ProteinA蛋白的B功能结构域进行部分位点突变，形成ProteinA
‑
1和ProteinA
‑
2；
[0013]构建重组质粒，原核体系诱导表达，表达的重组ProteinA蛋白经Ni亲和层析及离子交换层析分离纯化，纯度大于95％。
[0014]优选的，所述ProteinA
‑
1的突变位点包含：A176V、N178H，N181D，Q184A，E190K，N198T，N203G，G204A，N218A，A221S，D228E，A229S共12处突变，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0015]优选的，所述ProteinA
‑
2的突变位点包含：A176V，Q184H，E190K，N198S，N203G，G204A，D211H，N218A，A221S，D228E，A229S共11处突变，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0016]优选的，所述重组质粒的表达载体为pET30a，宿主菌为大肠杆菌宿主细菌BL21(DE3)，经过培养OD600为0.3～0.8时添加终浓度为0.1～1.0mM的IPTG，于18～37℃诱导表达3～8h。
[0017]优选的，Ni亲和层析工艺的结合缓冲液含有20mM咪唑，淋洗缓冲液含有40mM咪唑，洗脱缓冲液含有500mM咪唑；选用阴离子交换层析进行进一步纯化，流动相pH为7.0～9.0，采用盐离子浓度增加的方式洗脱目的蛋白。
[0018]本专利技术还公开了一种采用上述葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法制得的葡萄球菌蛋白A在亲和介质的配基中的应用。
[0019]本专利技术还公开了一种采用上述葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法制得的葡萄球菌蛋白A在抗体纯化及免疫诊断研究中的应用。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的优点是：
[0021]本专利技术构建获得的ProteinA蛋白，纯化制备工艺简单、收率高。并具有耐碱性高、热稳定性强、储存性良好及特异性吸附IgG能力强等优势，与固相载体偶联获得的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率高的优点。本专利技术涉及的葡萄球菌蛋白A纯化制备方法及应用针对当前市场需求极大的抗体纯化市场及相关的免疫诊断及筛查具有重要意义。
附图说明
[0022]此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0023]图1为本专利技术ProteinA蛋白构建的重组质粒示意图；
[0024]图2为本专利技术实施例2中纯化制备获得的ProteinA
‑
1和ProteinA
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2蛋白SDS
‑
PAGE电泳分析图；
[0025]图3为本专利技术实施例2中纯化制备获得的Protein A
‑
1和Protein A
‑
2蛋白耐碱性测试的SDS
‑
PAGE电泳分析图；
[0026]图4为本专利技术实施例2中ProteinA
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1和ProteinA
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2蛋白偶联固相获得的亲和介质特异性吸附IgG抗体的测试结果分析图；
[0027]图5为本专利技术实施例2中ProteinA
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2固相亲和介质的耐碱性测试结果分析图。
具体实施方式<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种葡萄球菌蛋白A，其特征在于：所述葡萄球菌蛋白A的B功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。2.一种如权利要求1所述的葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法，其特征在于：所述方法包括将来源于葡萄球菌的ProteinA蛋白的B功能结构域进行部分位点突变，形成ProteinA
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1和ProteinA
‑
2；构建重组质粒，原核体系诱导表达，表达的重组ProteinA蛋白经Ni亲和层析及离子交换层析分离纯化，纯度大于95％。3.根据权利要求1所述的一种葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法，其特征在于：所述Protein A
‑
1的突变位点包含：A176V、N178H，N181D，Q184A，E190K，N198T，N203G，G204A，N218A，A221S，D228E，A229S共12处突变，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。4.根据权利要求2或3所述的一种葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法，其特征在于：所述Prote...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙英，叶贤龙，郭志谋，于伟，高岩华，熊京京，徐思梦，胡文峰，
申请(专利权)人：赣江中药创新中心，
类型：发明
国别省市：