一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法及应用技术

本发明专利技术公开一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，包括原料处理、流洗处理、酶处理、脱洗处理、浸泡处理、消毒处理、无菌处理等步骤，其中脱洗处理步骤再次使用了酶制剂。本发明专利技术还公开一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽在烧烫伤皮肤修复材料中的应用。本发明专利技术采用酶解提取法，保留了细胞外基质的完整性；采用二次酶解技术，第一次酶解脱去猪膀胱中的细胞，第二次酶解将细胞外基质分解成小分子状态，结合原料处理、流洗处理、脱洗处理、浸泡处理、消毒处理、无菌处理等步骤，形成一套完整、严谨的工艺路线，提取获得原料级猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽，为医药辅料行业提供用于烧烫伤皮肤修复的原料产品。的原料产品。

【技术实现步骤摘要】
一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法及应用


[0001]本专利技术属于组织工程
，具体涉及一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法及应用。

技术介绍

[0002]动物组织经过剥离获取有用部分，再经过除脂、除细胞、除抗原等后制作成的生物材料，统称为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)。猪膀胱脱细胞基质(urinarybladder matrix，UBM)属于该细胞外基质中的一种。UBM具有无侵蚀性、组织相容性好、能诱导组织再生、形成瘢痕少等优点，且还能诱导血液中游离的多种成体干细胞向植入部位富集，并分化为神经、血管、平滑肌、心肌、鼓膜、肌腱以及气管等多种有效组织，从而达到组织修复的目的，是盆底高分子补片的理想替代材料。相较于其他脱细胞基质材料，UBM在器官损伤修复过程中，发挥调节细胞生长、分化和迁移的作用。同时，UBM在经分层、脱细胞、消毒及冻干等处理后比其他ECM材料在结构上更易保留完整的基底层，对参与组织修复的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)有独特的较强亲和力和粘附力。
[0003]膀胱脱细胞基质组织工程越来越受到人们的关注。猪膀胱脱细胞外基质来源广泛，具备天然的细胞外支架结构，成为组织工程膀胱替代材料研究的热点。猪膀胱中的细胞外基质具有很好的促进细胞再生的功能，很多专家学者都在研究其中的功能和机理。已经应用的方向为膀胱修复术，主要是利用其纤维结构的支撑作用，同时其天然可降解的特性都是良好的修复术的生物材料。而其中含有的纤维蛋白、丝蛋白、胶原蛋白、生长因子、信号传递子等物质对皮肤修复具有良好的促进作用。现有实验室和小规模提取的方案都是整张提取，过程繁琐，操作难度高，成功率低，产品稳定性差。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术提供一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，采用酶解提取法，保留了细胞外基质的完整性；采用二次酶解技术，第一次酶解脱去猪膀胱中的细胞，第二次酶解将细胞外基质分解成小分子状态，结合流洗、浸泡、消毒、无菌处理等步骤，提取获得原料级猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽，为医药辅料行业提供用于烧烫伤皮肤修复的原料产品。本专利技术提取方法耗时短，产品得率高，适合小规模批量生产应用。
[0005]本专利技术的技术方案如下：
[0006]一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，包括以下步骤：
[0007]A、原料处理：将猪膀胱对半切开，用清水清洗干净，然后用稀酸溶液浸洗25～35min，再用纯净水漂洗至pH值6.5～7，再用稀碱溶液浸洗20～35min，再用纯净水漂洗至pH值7～7.5，离心机沥干水分，备用；
[0008]B、流洗处理：按料液比为1:12～1:18向上述原料中加入缓冲溶液，升温至38～42℃，然后恒温流洗8～10h；
[0009]C、酶处理：流洗后的物料排空缓冲溶液，按料液比为1:10～1:15加入复合生物酶解液，恒温流洗酶解4～8h；
[0010]D、脱洗处理：酶解后的物料排空酶解液，用缓冲溶液漂洗两次，按料液比为1:10加入脱洗液，持续流洗搅拌10～12h；
[0011]E、浸泡处理：脱洗后的物料排空脱洗液，用缓冲溶液漂洗干净，按料液比为1:8～1:10加入浸泡液，浸泡流洗10～15h；
[0012]F、消毒处理：浸泡后的物料排空浸泡液，按照料液比约1:5～1:8加入消毒剂，搅拌、流洗、浸泡1～2h；
[0013]G、无菌处理：消毒后的物料排空消毒剂，用无菌抗菌剂浸泡，无菌包装，4℃保存。
[0014]进一步，步骤A中所述稀酸溶液为盐酸溶液或乙酸溶液，摩尔浓度为0.1～0.2mol/L；所述的稀碱溶液为氢氧化钠溶液，摩尔浓度为0.2～0.3mol/L。
[0015]进一步，步骤B中升温速率不超过2.2℃/min。
[0016]进一步，步骤C中所述的复合生物酶解液包括胰蛋白酶、碱性蛋白酶、EDTA。
[0017]进一步，所述的胰蛋白酶质量分数为0.2～0.3％，活性为5万U/g；所述的碱性蛋白酶质量分数为0.1％～0.2％，活性为10万U/g；所述的EDTA的质量分数为0.3～0.5％。
[0018]进一步，步骤D中所述的脱洗液由包含氯化钠、DNA酶、RNA酶的溶解液通过0.22微米微孔过滤两次而得；其中，氯化钠摩尔浓度为0.8～1.5mol/L，所述的DNA酶、RNA酶的活性为4万U/L。
[0019]进一步，步骤E中所述的浸泡液为质量浓度为3～6％的脱氧胆酸钠溶液。
[0020]进一步，步骤F中所述的消毒剂由纯净水和二溴海因调配至活性溴含量为200ppm而得。
[0021]进一步，步骤G中所述无菌抗菌剂由DMDMH质量浓度为0.2～0.3％、pH值为7的PBS缓冲溶液通过无菌0.22微米折叠滤芯3次过滤得到。
[0022]进一步，所述的缓冲溶液为磷酸二氢钠缓冲溶液，pH值为7。
[0023]本专利技术细胞外基质蛋白肽分子量集为500～1500道尔顿，片状或粉状，可生物降解或吸收，有蛋白特有鲜腥气味，气味清淡，颜色淡黄色至乳白色。
[0024]本专利技术还提供一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽在烧烫伤皮肤修复材料中的应用。
[0025]本专利技术相比于现有技术的有益效果为：
[0026]1、本专利技术采用酶解提取法，保留了细胞外基质的完整性；采用二次酶解技术，第一次酶解在酶处理步骤中进行，脱去猪膀胱中的细胞；第二次酶解在脱洗处理步骤进行，采用含有DNA酶、RNA酶的溶解液作为脱洗液，将细胞外基质分解成小分子状态，结合流洗、浸泡、消毒、无菌处理等步骤，能够提取获得原料级猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽，为医药辅料行业提供用于烧烫伤皮肤修复的原料产品。
[0027]2、本专利技术提取方法工艺简单，能耗低，科学合理的选择酶制剂进行酶解，整体耗时短，产品得率高，适合小规模批量生产应用。
具体实施方式
[0028]下面通过具体实施例对本专利技术进行详细说明。
[0029]实施例1
[0030]一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，包括以下步骤：
[0031]A、原料处理：将4kg猪膀胱对半切开，用清水清洗干净，然后用稀酸溶液浸洗25min，所述稀酸溶液为盐酸溶液或乙酸溶液，摩尔浓度为0.1mol/L；再用纯净水漂洗至pH值6.5；再用稀碱溶液浸洗20min，所述的稀碱溶液为氢氧化钠溶液，摩尔浓度为0.2mol/L；再用纯净水漂洗至pH值7，离心机沥干水分，备用；
[0032]B、流洗处理：向上述原料中加入52kg pH值为7的磷酸二氢钠缓冲溶液，升温至38℃，升温速率为2.2℃/min，然后恒温流洗8h；
[0033]C、酶处理：流洗后的物料排空缓冲溶液，加入40kg复合生物酶解液，所述的复合生物酶解液包括胰蛋白酶、碱性蛋白酶、EDTA；其中，胰蛋白酶质量分数为0.2％，活性为5万U/g；碱性蛋白酶质量分数为0.1％，活性为10万U/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：A、原料处理：将猪膀胱对半切开，用清水清洗干净，然后用稀酸溶液浸洗25～35min，再用纯净水漂洗至pH值6.5～7，再用稀碱溶液浸洗20～35min，再用纯净水漂洗至pH值7～7.5，离心机沥干水分，备用；B、流洗处理：按料液比为1:12～1:18向上述原料中加入缓冲溶液，升温至38～42℃，然后恒温流洗8～10h；C、酶处理：流洗后的物料排空缓冲溶液，按料液比为1:10～1:15加入复合生物酶解液，恒温流洗酶解4～8h；D、脱洗处理：酶解后的物料排空酶解液，用缓冲溶液漂洗两次，按料液比为1:10加入脱洗液，持续流洗搅拌10～12h；E、浸泡处理：脱洗后的物料排空脱洗液，用缓冲溶液漂洗干净，按料液比为1:8～1:10加入浸泡液，浸泡流洗10～15h；F、消毒处理：浸泡后的物料排空浸泡液，按照料液比约1:5～1:8加入消毒剂，搅拌、流洗、浸泡1～2h；G、无菌处理：消毒后的物料排空消毒剂，用无菌抗菌剂浸泡，无菌包装，4℃保存。2.根据权利要求1所述的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，其特征在于：步骤A中所述稀酸溶液为盐酸溶液或乙酸溶液，摩尔浓度为0.1～0.2mol/L；所述的稀碱溶液为氢氧化钠溶液，摩尔浓度为0.2～0.3mol/L。3.根据权利要求1所述的猪膀胱脱细胞外基质蛋白肽的提取方法，其特征在于：步骤B中升温速率不超过2.2℃/min。4.根据权利要求1所述的猪膀...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶明生，
申请(专利权)人：南宁东恒华道生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：