一种生物表面活性剂脂肽的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种生物表面活性剂脂肽(surfactin)的分离纯化方法，将含surfactin的发酵液离心去除菌体后，加入浓硫酸使其沉淀，然后用水洗涤沉淀，最后用含有NaOH的乙醇溶液对沉淀进行萃取。此方法能够高效去除surfactin发酵液中的小分子杂质和大分子蛋白质，surfactin纯度可达96％左右，回收率可达97％以上，相比于传统的分离方法，具有显著的优势。所述surfactin为枯草芽孢杆菌代谢产生的脂肽生物表面活性剂，主要是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵所产生的次级代谢产物。本发明专利技术提供的分离纯化方法操作简单、绿色环保、成本低且产品纯度和回收率都较高，能够有效地应用于surfactin的实际工业化分离。有效地应用于surfactin的实际工业化分离。有效地应用于surfactin的实际工业化分离。

【技术实现步骤摘要】
一种生物表面活性剂脂肽的分离纯化方法


[0001]本专利技术涉及一种生物表面活性剂的分离纯化新方法，尤其涉及生物表面活性剂脂肽(surfactin)的分离纯化新方法。

技术介绍

[0002]表面活性剂是一类由亲油的非极性基团和亲水极性基团组成，在溶液表面能够定向排列，即使在浓度很低的情况下也能显著地降低表/界面张力。表面活性剂独特的两亲性结构使其具有良好的分散、增溶、润湿等功能，素有“工业味精”的美誉，广泛应用于食品、乳品、造纸、制革、玻璃、石油、化纤、纺织、医药、建筑等传统工业。但随着人们生活水平的提高，表面活性剂的安全性受到了很大关注。化学工业给人类生活带来了极大方便，但同时其制造过程及终端产品也造成环境污染，严重危害生态环境及人类健康。当今社会人们已无法离开使环境和健康急剧恶化的化学工业及其产品，因此许多国家已将“绿色化学”作为化学工业今后发展的指导性方向。对与环境和健康密切相关的精细化学品—表面活性剂来说，绿色化学的指导原则尤为重要。生物表面活性剂就是在“表面活性剂绿色化”的理念下发展起来的。可在众多领域内替代化学表面活性剂，符合当代绿色可持续发展的工业生产理念。
[0003]Surfactin主要由革兰氏阳性菌的芽孢杆菌属细菌发酵产生的脂肽类生物表面活性剂，由含7个氨基酸残基的亲水肽和含13
‑
16个碳的疏水β
‑
羟基脂肪酸以内酯键结合而成，卓越的表/界面活性和良好的生物相容性使得surfactin在食品工业、微生物强化采油(MEOR)、环境保护等领域具有良好的应用前景，尤其是在日化、医药等高附加值领域。但目前，尚未见surfactin的工业化应用，这与其生产成本高有关。其中，下游分离技术占了整个生产成本的60
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70％。目前surfactin的主要分离工艺为酸化促沉淀，然后通过二氯甲烷或氯仿进行萃取，最后借助柱层析进行精制纯化。但该工艺需要耗费大量有毒有害的有机溶剂，这些溶剂的残留限制了surfactin的高附加值应用，此外上述分离过程中的surfactin回收率和纯度也无法满足实际生产需要。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对现有技术的不足，提供一种surfactin的分离纯化方法。利用本专利技术分离纯化surfactin，其回收率可达97％以上，纯度可达到96％。
[0005]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种生物表面活性剂脂肽的分离纯化方法，包括以下步骤：
[0006](1)将生物表面活性剂脂肽发酵液离心去除菌体Bacillus subtilis，向上清液中加酸调节pH值至酸性，离心后收集底部沉淀；
[0007](2)将步骤(1)中收集的沉淀进行洗涤；
[0008](3)将步骤(2)中洗涤后的沉淀加入有机溶剂萃取，所述有机溶剂与沉淀体积比3:1，并加入碱性固体至碱性固体的浓度为0.2
‑
0.5g/L，充分搅拌，离心后收集有机相，然后通
过旋转蒸发去除有机相，干燥后获得生物表面活性剂脂肽纯品。
[0009]进一步地，步骤(1)中，所述酸优选为浓硫酸、浓盐酸、磷酸。
[0010]进一步地，步骤(1)中所述酸性pH值优选为2
‑
4。
[0011]进一步地，步骤(2)中的洗涤为用0.1
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0.5M的稀盐酸或者去离子水洗涤沉淀。
[0012]进一步地，步骤(2)中又以去离子水洗涤为佳；洗涤时去离子水的加入量为沉淀体积的1
‑
3倍；洗涤次数为1
‑
3次，又以2次为佳。
[0013]进一步地，所述步骤(3)中，所用的有机溶剂优选为甲醇、乙醇。
[0014]进一步地，所述步骤(3)中，所用的有机溶剂更优选为乙醇。
[0015]进一步地，所述步骤(3)中，所述的碱优选为NaOH、KOH固体。
[0016]进一步地，所述步骤(3)中，所述加入碱性固体至浓度优选为0.2
‑
0.4g/L。
[0017]本专利技术的有益效果：
[0018]1、本专利技术能够有效地从发酵液中分离回收surfactin，采用酸化促沉淀结合乙醇提取和固液萃取的方法，在优选条件下，surfactin产品的回收率可达97％以上，纯度可达96％。
[0019]2、本专利技术创新性地采用乙醇代替传统分离工艺的二氯甲烷用于surfactin的分离纯化，显著提高了surfactin的纯度。与二氯甲烷相比，乙醇用于萃取，由于其与水互溶的特性，避免了surfactin反胶束的形成，从而很好地避免了在分离过程中包裹蛋白质的现象发生，对surfactin产品纯度的提升具有显著的帮助。此外，乙醇作为有机溶剂用于surfactin萃取，低毒、安全、能够回收重复利用、经济环保，为surfactin在食品、医药、化妆品等领域的应用奠定良好的基础。
[0020]3、本专利技术采用乙醇等水溶性有机溶剂，萃取回收surfactin。分离得到的产品纯度高达96％以上，显著优于传统分离工艺的90％左右；该分离过程操作简单，易于放大，适合产物的大量制备，可应用于工业化生产。
附图说明
[0021]图1为surfactin分离纯化流程示意图。
具体实施方式
[0022]Surfactin是一种主要由枯草芽孢杆菌利用葡萄糖为碳源发酵生产的脂肽类生物表面活性剂。由含7个氨基酸残基的亲水肽环和含13
‑
16碳的疏水β
‑
羟基脂肪酸链以内酯键结合而成，其结构式如下所示：
[0023][0024]下面结合实施例与对比例，对本专利技术进行进一步的阐述。
[0025]实施例1脂肽(surfactin)的发酵制备
[0026]发酵菌属为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC21332。LB培养基的成分为：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，pH7.0。
[0027]发酵培养基成分为：葡萄糖40g/L、Na2HPO4·
12H2O 10.74g/L、NH4H2PO
4 5.75g/L、NaNO
3 1.7g/L、KNO
3 3.0g/L、MgSO
4 0.1g/L、EDTA
‑
Fe 0.2mM、CaCl
2 0.777mg/L、NaOH 0.85g/L。
[0028]将Bacillus subtilis ATCC21332甘油管在LB培养基中活化，培养条件为：30℃，200rpm，培养24h后，按照3％的接种量接种于100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养72h。收集发酵液，离心去除菌体后，可获得surfactin的无菌发酵液。
[0029]实施例2不同有机溶剂提取surfactin的回收率和纯度
[0030]取100mL实例1中制备的发酵液，向其中加入浓硫酸至硫酸的体积分数本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物表面活性剂脂肽的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将生物表面活性剂脂肽发酵液离心去除菌体Bacillus subtilis，向上清液中加酸调节pH值至酸性，离心后收集底部沉淀；(2)将步骤(1)中收集的沉淀进行洗涤；(3)将步骤(2)中洗涤后的沉淀加入有机溶剂萃取，所述有机溶剂与沉淀体积比3:1，并加入碱性固体至碱性固体的浓度为0.2
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0.5g/L，充分搅拌，离心后收集有机相，然后通过旋转蒸发去除有机相，干燥后获得生物表面活性剂脂肽纯品。2.根据权利要求1所述的生物表面活性剂脂肽分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酸优选为浓硫酸、浓盐酸、磷酸。3.根据权利要求1所述的生物表面活性剂脂肽分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述酸性pH值优选为2
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4。4.根据权利要求1所述的生物表面活性剂脂肽分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中的洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙旭伟，于樊，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：