一种四环素调控蛋白突变体基因及其在调控基因表达和环境检测中的应用制造技术

一种四环素调控蛋白突变体基因及其在调控基因表达和环境检测中的应用，涉及基因工程全菌生物传感器及基因表达调控领域，四环素类抗生素诱导型操纵子基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。该四环素类抗生素诱导型操纵子是野生型四环素调控蛋白TetR的突变子，可直接用于四环素类抗生素诱导型生物传感器的优化构建，用于检测四环素类抗生素含量，检测限高，具有良好的专一性，并且可检测包含四环素在内的八种四环素类抗生素。该四环素类抗生素诱导型操纵子基因还可用于基因表达调控，其对Dox的响应性能提高，低浓度的Dox就可使下游基因表达沉默，尽可能降低药物处理对实验结果的影响，确保实验结果的准确性。确保实验结果的准确性。确保实验结果的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种四环素调控蛋白突变体基因及其在调控基因表达和环境检测中的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程全菌生物传感器及基因表达调控领域，具体是涉及一种四环素调控蛋白突变体基因及其在调控基因表达和环境检测中的应用。

技术介绍

[0002]四环素转录调控因子TetR(tetracycline repressor)调控蛋白是来自于大肠杆菌Tn10转座子，控制四环素溢出泵基因的表达，与细菌耐药性相关。TetR与Tet操纵子(Tet operator,TetO)能够特异性结合。Tet表达调控系统通过诱导药物(如四环素)改变调控蛋白的构象，从而达到调控目标蛋白表达的目的。当细胞内无Tet存在时，TetR会与TetO结合，从而阻断下游抗性基因表达；当有Tet存在时，Tet使TetR构象发生改变，导致TetR与TetO分离，下游抗性基因得以表达，细菌获得耐药性。基于TetR调控蛋白蛋白可与特定核苷酸序列结合并调控下游基因表达的特点，TetR常被用于构建Tet表达调控系统，用于环境中四环素类抗生素的检测及蛋白表达调控。
[0003]四环素类抗生素以其价格低廉、广谱抗菌等特点而被广泛使用，由于难以在环境中降解，其引起的环境污染问题引起了广泛关注。有研究表明，环境中的抗生素除了会造成化学污染外，还可能会诱导和加速环境中抗性微生物和抗性基因的产生，加速抗生素抗性基因的传播和扩散。这些抗性微生物通过直接或间接接触的方式进入人体，增强人体的耐药性，给人类安全健康造成威胁。致病菌耐药性的增加和扩散已经成为全球疾病治疗面临的一个巨大问题。要解决这一根本问题，准确检测环境中的抗生素并对环境中抗生素药物的去除机制及其环境行为开展研究是十分必要的。
[0004]由于环境中抗生素类药物的浓度相对较低，并且环境基质复杂，传统检测方法准确定量环境中的四环素类抗生素需要一套完整的样品预处理方法和仪器检测技术如气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)等。然而，这些方法虽然精确灵敏却需要繁琐的预处理且操作过程复杂，需要投入专业人员及高昂的资金设备。因此，开发一种更加便捷、廉价易操作的新型抗生素检测手段是目前亟待解决的问题。
[0005]近年来，随着生物技术的快速发展及基因工程手段的日趋成熟，生物传感器技术的出现为环境抗生素的检测提供了一种新的手段。生物传感器可通过生物感应元件将待测物浓度与可检测的信号建立浓度梯度关系，在污染物的分析中具有极大的发展潜力和前景。四环素类抗生素生物传感器利用大肠杆菌中Tet阻遏蛋白可与Tet操纵子特异性结合的特性，以TetR调控蛋白作为感应元件，对四环素类抗生素进行检测。野生型的TetR调控蛋白仅对Tet、Dox等少数几种结构极其相近的四环素类抗生素具有响应，而对替加环素、米诺环素等几种近几年来使用更加广泛的四环素衍生物类药物响应性低甚至无响应，并且野生型的TetR表达调控系统需要一个相对较高的诱导物浓度才能启动。这也导致了现有四环素类抗生素生物传感器检测限低、不够广谱、不够灵敏等缺陷。
[0006]Tet调控系统除被应用于环境抗生素检测外，还常被用于调控基因表达。目前研究
人员发展了多种类型的Tet调控系统，根据其表达特点可以归为两大类:Tet
‑
off抑制型系统和Tet
‑
on激活型系统。
[0007]抑制型Tet
‑
off基因表达调控系统最早是由是Gossen等人建立的，该系统由调控元件和反应元件两个主要部分组成。调控元件包含一个由人巨细胞病毒早期启动子(P
hCMV
)启动的Tet转录活化因子(tetracycline transcriptional activator,tTA)，Tet转录活化因子由TetR与单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白质C端的一段转录激活区融合而成。反应元件由最小CMV启动子(minimal CMV promoter,P
minCMV
)、Tet响应元件(Tet
‑
responsive element,TRE)、及目的基因组成。其中TRE为重复7次的TetO序列，目的基因位于TRE和P
minCMV
的下游。P
minCMV
缺少增强子，因此在tTA与TRE未结合时，P
minCMV
无法启动，目的基因不表达；相反，当tTA与TRE结合时，VP16的存在会使P
minCMV
活化从而使下游目的基因表达。当细胞内无Tet或强力霉素(doxycycline,Dox)的存在时，tTA可与TRE结合，而当细胞内含有Tet或Dox存在时，Tet或Dox与tTA中的TetR部分结合，使TetR构象发生变化，rTA从TRE上脱落，P
minCMV
处于未激活状态，下游基因表达终止。
[0008]Tet
‑
on调控系统与Tet
‑
off调控系统的区别在于Tet
‑
on系统的调控蛋白为反义Tet转录活化因子(reverse tetracycline transcriptional activator,rtTA)。rtTA是由反义TetR(reverse TetR,rTetR)与VP16的转录活化区域融合而成的。rTetR与TetR相比发生了4个氨基酸突变(E71
→
K71，D95
→
N95，L101
‑
S101，G102
→
D102)。rTetR的表型与TetR相反，当无Dox存在时不能与TRE结合，下游基因表达关闭；而当有Dox存在时才能与TRE结合，使下游基因表达。
[0009]Tet
‑
off/Tet
‑
on基因表达系统自推出以来，由于其严密、高效、可控性强、表达泄露小等优点，在很多方面得到了广泛的应用，尤其是在基因的表达调控及基因治疗方面。如今已被广泛应用于各种细胞系、植物、酵母、线虫、小鼠、大鼠及人源细胞的基因诱导表达。虽然Tet
‑
off/Tet
‑
on系统为基因功能研究提供了便利，但是长期使用抗生素，已知可导致临床不良反应。四环素浓度过高可能对生物实验带来负面影响：四环素会改变线粒体基因组的表达，并且破坏细胞呼吸链的功能。即使在低浓度时，四环素也能诱导线粒体蛋白毒性压力，导致核基因表达的变化，改变线粒体功能。因此，开发一种可以低浓度Dox启动的Tet
‑
off调控基因表达系统是及其有必要的。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于提供了一种可特异性响应四环素类抗生素的四环素调控蛋白突变体基因及其在环境检测和调控基因表达中的应用，以解决现有技术的基于四环素调控系统构建的细菌生物传感器检测限低、不够灵敏、广谱性低；以及在运用Tet
‑
off基因表达调控系统调控基因表达中四环素处理浓度过高对生物实验带来负面影响的技术问题。
[0011]为了实现上述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种四环素调控蛋白突变体基因，为四环素类抗生素诱导型操纵子基因，具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。2.一种含有如权利要求1所述四环素调控蛋白突变体基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体含有与所述的四环素类抗生素诱导型操纵子基因可操作性连接的标记基因，所述标记基因位于所述四环素类抗生素诱导型操纵子基因的下游。3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述标记基因为绿色荧光蛋白表达基因。4.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的出发载体为pSB1K3载体。5.如权利要求2～4任一所述重组载体作为四环素类抗生素诱导型生物传感器在检测四环素类抗生素含量中的应用。6.含有如权利要求2～4任一所述重组载体的工程菌作为四环素类抗生素诱导型生物传感器在检测四环素类抗生素含量中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述四环素类抗生素为四环素、Dox、地美环素、米诺环素、美他环素、土霉素、金霉素、替加环素。8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述工程菌为含有所述重组载体的Top10。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，工程菌作为四环素类抗生素诱导型生物传...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴李君，李顺兰，陈少鹏，陈东东，陶诗频，徐升敏，肖翔，
申请(专利权)人：皖南医学院，
类型：发明
国别省市：