提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用技术

本发明专利技术提供了提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用，Aokap1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术通过敲除Aokap1基因可以提高米曲霉曲酸产量，这对于构建米曲霉曲酸高产菌株提供了新靶点和新途径。曲酸高产菌株提供了新靶点和新途径。曲酸高产菌株提供了新靶点和新途径。

【技术实现步骤摘要】
提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用。

技术介绍

[0002]曲酸，化学名称为5
‑
羟基
‑2‑
羟甲基
‑
1，4
‑
吡喃酮，是一种由微生物发酵产生的有机酸，广泛存在于酒类、酱油及豆瓣酱等酿造产品中。由于具有抑菌功效、抗氧化活性、螯合金属离子和抑制酪氨酸酶活性等性质，曲酸常用作抗菌剂、防腐剂、保鲜剂和美白剂等，被广泛应用在医药、农业、食品和化妆品等各个产业。目前，国内外曲酸的生产主要通过米曲霉菌株发酵而成。由于直接从自然界获得的米曲霉菌株产生的曲酸产量并不高，通常需要对菌株进行诱变处理，之后通过筛选得到曲酸高产菌株，但目前研究表明利用诱变提高米曲霉曲酸产量的效果已明显降低，不能满足日益增长的曲酸市场需求。

技术实现思路

[0003]为解决上述技术问题，本专利技术提供了提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用。
[0004]为了实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0005]本专利技术提供了提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1，Aokap1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0006]本专利技术还提供了特异性靶向基因Aokap1的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0007]本专利技术还提供了含有上述sgRNA的CRISPR
‑
>Cas9
‑
Aokap1敲除载体。
[0008]本专利技术还提供了提高米曲霉曲酸产量的方法，通过敲除基因Aokap1实现。
[0009]优选地，上述方法包括将CRISPR
‑
Cas9
‑
Aokap1敲除载体转入米曲霉3.042菌株。
[0010]优选地，上述方法包括以下步骤：
[0011]1)以米曲霉RIB40菌株的基因组DNA作为模板，用正向引物和含有Aokap1的靶向序列的反向引物扩增U6启动子，获得PU6
‑
Aokap1片段；
[0012]2)以sgRNA和U6终止子序列为模板，将Aokap1靶基因的靶向序列作为引物接头，PCR扩增获得Aokap1
‑
sgRNA
‑
TU6，从而将Aokap1靶向序列连接到sgRNA
‑
TU6的N端，获得Aokap1
‑
sgRNA
‑
TU6片段；
[0013]3)将PU6
‑
Aokap1和Aokap1
‑
sgRNA
‑
TU6进行重叠PCR，获得含有Aokap1基因靶向序列的sgRNA表达盒PU6
‑
Aokap1
‑
sgRNA
‑
TU6；
[0014]4)将线性化的CRISPR
‑
Cas9载体与PU6
‑
Aokap1
‑
sgRNA
‑
TU6重组连接获得pPTRII
‑
Cas9
‑
Aokap1敲除载体；
[0015]5)利用原生质体转化法将pPTRII
‑
Cas9
‑
Aokap1敲除载体转入米曲霉3.042菌株。
[0016]更优选地，步骤1)中，正向引物和含有Aokap1的靶向序列的反向引物分别为：
[0017]PU6
‑
F：CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTAATGCCGGCTCATTCAAA；
[0018]PU6
‑
Aokap1
‑
R：CGGTGGGCCTGATTGTAGGTGACTTGTTCTTCTTTACAATGATTTATTTA；
[0019]步骤2)中，
[0020]TU6
‑
Aokap1
‑
F：CACCTACAATCAGGCCCACCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA；
[0021]TU6
‑
R：AATTCGAGCTCGGTACCCGGGAGCAGCTCTATATCACGTGACG。
[0022]优选地，还包括利用KOD DNA聚合酶扩增Aokap1靶向序列，测序分析突变情况，从而获得Aokap1敲除菌株。
[0023]更优选地，以CRISPR
‑
S
‑
Aokap1
‑
F/R为引物，利用KOD DNA聚合酶扩增Aokap1靶向序列，其中：
[0024]CRISPR
‑
S
‑
Aokap1
‑
F：GGCTTCAACAGTTCTCCCGA；
[0025]CRISPR
‑
S
‑
Aokap1
‑
R：CTTGGTCACGAAGCAGGAGT。
[0026]本专利技术又提供了基因Aokap1在制备米曲霉Aokap1敲除菌株中的应用。
[0027]本专利技术的有益效果如下：
[0028]本专利技术提供了一个提高米曲霉曲酸含量的新基因：Aokap1基因。通过敲除Aokap1基因可以提高米曲霉曲酸产量，这对于构建米曲霉曲酸高产菌株提供了新靶点和新途径。
附图说明
[0029]图1CRISPR
‑
Cas9
‑
Aokap1敲除载体构建示意图。
[0030]图2Aokap1敲除菌株ΔAokap1的测序鉴定以及敲除Aokap1对米曲霉曲酸合成的影响，A.Aokap1敲除菌株ΔAokap1靶向位点突变情况；B.野生型3.042(WT)和Aokap1敲除菌株(ΔAokap1)在含有FeCl3的固体CD曲酸发酵培养基上的曲酸合成情况；C.野生型3.042(WT)和Aokap1敲除菌株(ΔAokap1)曲酸发酵液对比；D.野生型3.042(WT)和Aokap1敲除菌株(ΔAokap1)在液体CD曲酸发酵培养基中发酵7天后曲酸含量的测定。
具体实施方式
[0031]为了更清楚地说明本专利技术，下面结合实施例并对照附图对本专利技术作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。
[0032]实施例
[0033]以下用到的相关引物见表1。
[0034]表1.引物信息
[0035][0036]本实施例的主要步骤如下：
[0037]一、利用CRISPR技术构建米曲霉Aokap1敲除菌株
[0038]1.米曲霉Aokap1基因的克隆
[0039]Aokap1基因位于米曲霉基因组一号染色体，由3个外显子组成，编码30本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1，Aokap1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.特异性靶向权利要求1所述的提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。3.含有权利要求2所述的sgRNA的CRISPR
‑
Cas9
‑
Aokap1敲除载体。4.提高米曲霉曲酸产量的方法，通过敲除权利要求1所述的提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1实现。5.根据权利要求4所述的提高米曲霉曲酸产量的方法，其特征在于，包括将CRISPR
‑
Cas9
‑
Aokap1敲除载体转入米曲霉3.042菌株。6.根据权利要求4所述的提高米曲霉曲酸产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以米曲霉RIB40菌株的基因组DNA作为模板，用正向引物和含有Aokap1的靶向序列的反向引物扩增U6启动子，获得PU6
‑
Aokap1片段；2)以sgRNA和U6终止子序列为模板，将Aokap1靶基因的靶向序列作为引物接头，PCR扩增获得Aokap1
‑
sgRNA
‑
TU6，从而将Aokap1靶向序列连接到sgRNA
‑
TU6的N端，获得Aokap1
‑
sgRNA
‑
TU6片段；3)将PU6
‑
Aokap1和Aokap1
‑
sgRNA
‑
TU6进行重叠PCR，获得含有Aokap1基因靶向序列的sgRNA表达盒PU6
‑
Aokap1
‑
sgRNA
‑
TU6；4)将线性化的CRISPR
‑
Cas9载体与PU6
‑
Aokap1
‑
sgRNA
‑
TU6重组连接获得pPTRII
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张焕欣，张哲，曾斌，陈梓铭，李玉珍，陈天铭，范俊侠，
申请(专利权)人：江西科技师范大学，
类型：发明
国别省市：