一种脂质转运蛋白基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种脂质转运蛋白基因RTA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质；本发明专利技术将带有潮霉素基因标记的敲除基因片段以及pYES3

【技术实现步骤摘要】
一种脂质转运蛋白基因及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体地涉及一种土生隐球酵母编码脂质转运蛋白的基因RTA1，以及转基因RTA1酵母，以及它们在酸铝环境中的应用。

技术介绍

[0002]随着工业化的进展，大量的硫化物等物质排放在空气中，从而形成了酸雨，造成了许多地区存在土壤酸化的问题，如红壤地区。铝是地壳中含量最丰富的金属元素之一，约占地球总量的8%，其分布广泛而丰富。铝通常情况下以难溶性硅酸盐或氧化铝的形式存在，这些形态对生物毒性很微弱。随着酸雨现象的增加，土壤酸化的问题也越来越严重，土壤中铝离子的含量增加。其中在铝的各种化学形态中以无机单体铝(Al
3+
)对各种农作物产生的毒害作用最显著，Al
3+
的存在很大程度上取决于环境pH值(pH为3.0时Al
3+
的含量为100%，pH为4.5时Al
3+
的含量为80%，pH为6.0时Al
3+
的含量则不到10%)，所以铝毒是酸性土壤阻碍农作物生长的主要原因。铝能够影响生物的细胞膜结构，影响跨膜离子通道的活性，从而干扰细胞离子交换的稳态。有研究表明铝离子在土壤中的交换量约占阳离子的20
‑
80%，导致了阳离子流失过多，从而造成土壤中各种营养元素的缺乏，如钾、钙、镁等，间接影响农作物对水分和营养成分的吸收，导致农作物产量的下降。
[0003]如何科学有效处理铝毒问题成为了世界上有待解决的难题，有研究发现用石灰来提高土壤的pＨ值，从而达到降低铝毒害的目的，但是这样容易导致土壤结构板结，土壤肥力下降，水分流失和土壤微生物减少等问题。在酸性的高铝土壤中，接种一些菌根真菌可以提高幼苗的存活率，其原因是菌根真菌活化了根际土壤中的难溶性磷酸盐，对游离态铝离子进行沉淀，从而减少铝毒对农作物的危害。菌根真菌提高植物耐铝作用的原因有：（1）菌根真菌通过菌丝生长而增加营养元素的吸收范围，体外排斥或分泌有机酸与Al
3+
鳌合，使其沉淀，阻止其向植物根系运输等方式来减弱铝毒的影响；（2）菌根真菌的菌丝细胞壁的特殊结构可分离有毒金属离子，通过降低Al
3+
含量达到减弱Al
3+
对植物的伤害。所以有研究表明，在低pH和高铝环境中，植树造林的方面使用人工接种优良的外生菌根真菌的方法是最有效的对策。
[0004]在植物中，脂质转运蛋白在抗非生物胁迫中起着一定的作用。在小麦中脂质转运蛋白参与多种环境胁迫的响应，如低温、干旱、氧化胁迫等。在其他植物中，如玉米、拟南芥、芝麻等在面临上述的环境胁迫时，脂质转运蛋白的表达量也有所上升。真菌的脂质转运蛋白一般是由六个或者七个跨膜结构域组成的膜蛋白，跟动植物的脂质转运蛋白没有同源性，主要在真菌药物靶点方面有研究，而在真菌抗非生物胁迫方面未见报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种脂质转运蛋白基因RTA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质；其来源于土生隐球酵母（C. humicolus）BSLL1
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1菌株，基因序列全长1146bp，编码由381个氨基酸组成的脂质转运蛋白，分子量约为
42kDa。
[0006]本专利技术另一目的是将上述脂质转运蛋白基因RTA1应用在增强微生物抗酸胁迫或/和铝胁迫能力中。
[0007]为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：1、从云南省保山市龙陵县周边茶园茶树根际酸性土壤中分离的土生隐球酵母（C. humicolus）BSLL1
‑
1菌株中提取基因组DNA，送上海人类基因组研究中心进行基因组测序，得到RTA1基因序列。根据该序列设计引物，以土生隐球酵母cDNA为模板PCR扩增RTA1基因片段；将目的片段连接到pMD
‑
19T载体上，得到含有目的片段的重组载体pMD19
‑
T
‑
RTA1并热激转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，涂布含氨苄青霉素的平板上，挑取阳性菌落测序，鉴定出编码RTA1蛋白的基因，其序列如SEQ ID NO:1所示，该蛋白由381个氨基酸编码，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；测序正确后通过酶切连接的方法构建pYES3
‑
RTA1重组载体；然后在INVSc1感受态酵母细胞中加入pYES3
‑
RTA1重组载体，然后进行电击转化，将混合液涂于缺Trp平板上筛选获得转基因RTA1酵母。
[0008]2、RTA1基因重组片段的构建将RTA1基因的前1120bp核苷酸（RTA1基因外的前1120位核苷酸）、后1080bp核苷酸（RTA1基因外的后1080位核苷酸）和潮霉素基因三个独立片段分别设计扩增引物，前基因的反向引物与后基因的正向引物都带有一段同源臂；分别以RTA1前臂和潮霉素基因为模板，扩增得到RTA1前臂：前2/3潮霉素片段；以潮霉素基因与RTA1后臂为模板，扩增得到后2/3潮霉素：RTA1后臂重组片段；然后以上述两个重组片段为模板进行重叠延伸PCR，得到的重组片段RTA1前臂：潮霉素基因：RTA1后臂，命名为RTA1F：hyg：RTA1R；3、然后在土生隐球酵母感受态细胞中加入测序正确的重组片段RTA1F：hyg：RTA1R，然后进行电击转化，将混合液涂于含300μg/mL 潮霉素的YPD平板上筛选发生同源重组的土生隐球酵母突变体菌株；从潮霉素平板上挑取单菌落，用PCR和real
‑
time PCR方法检测敲除是否成功；4、本专利技术比较了土生隐球酵母野生型菌株和土生隐球酵母突变型菌株、步骤1中的转基因RTA1酵母和未转基因酵母在酸铝胁迫下的生长情况配制pH分别为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5的GM固体培养基；配制pH4.5含铝离子的GM固体培养基，铝离子在GM固体培养基中的终浓度为50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L；将土生隐球酵母野生型菌株、土生隐球酵母突变型菌株接种到YPD液体培养基中摇床培养过夜；按1%（v/v）接种量转接至新鲜的YPD液体培养基中，将菌液浓度调到OD
600
为1；将菌液分别稀释至10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4，每个浓度菌液分别取1.5
µ
L接种到含有不同pH的GM固体平板上；在含铝离子的GM固体培养基上每个浓度菌液分别取2.5
µ
L接种，每种设置三个平板作为重复，在28℃下培养，观察不同菌株在酸铝胁迫下的生长情况；将初始OD
600
=0.2的土生隐球酵母野生型菌株、土生隐球酵母突变型菌株接种于pH4.5、50mmol/L Al
3+
的GM液体培养基中，28℃、200rpm培养，每隔2h测OD
600
值，绘制生长曲线，以及在显微镜下观察pH4.5、不含铝离子的GM液体培养基中，pH4.5、铝离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂质转运蛋白基因RTA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：年洪娟，李拥，陈麓，李昆志，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：