一种人血浆中色氨酸及其代谢产物检测方法技术

本发明专利技术提供一种人血浆中色氨酸及其代谢产物检测方法，属于生物技术检测领域，其先向生物样品加入同位素标记的色氨酸及代谢物作为内标，再通过液

【技术实现步骤摘要】
一种人血浆中色氨酸及其代谢产物检测方法


[0001]本专利技术属于生物技术检测领域，尤其涉及一种快速高效提取和检测人血浆中二十五种色氨酸及其代谢产物的新方法。

技术介绍

[0002]肠道微生物群在人体生理学中起着重要作用，其中许多都是通过肠道菌群本身产生的代谢物，或由环境或宿主的分子通过肠道菌群转化而来的代谢物介导的。在这些代谢产物中，有一种是必需的芳香族氨基酸色氨酸(Trp)。在肠道菌群直接或间接作用下，肠道中有三种主要Trp代谢途径，其代谢产物有血清素(5
‑
羟色胺)、犬尿氨酸(Kyn)和吲哚类衍生物。Trp代谢的紊乱与炎症性肠病、肠易激综合征、代谢综合征和相关并发症(糖尿病、肥胖症，非酒精性脂肪肝(NAFLD)、胰岛素抵抗和动脉粥样硬化，以及神经精神特性(尤其是焦虑、抑郁和孤独症)等密切相关，因此成为是近年来研究最多的一类肠道菌群代谢物。
[0003]然而，目前对这类物质存在着前处理制备方法成本较高、提取耗费时间较长且样品得率少导致检测困难等问题。因此如何开发一种低成本、快捷、能够提高目标产物的得率，提高质谱检测限、降低检测噪声的方法是现有技术有待解决的关键技术问题。

技术实现思路

[0004]基于现有技术中存在上述问题，本专利技术提供一种快速高效提取和检测人血浆中二十五种色氨酸及其代谢产物的新方法，通过优化提取方法步骤，质谱上机检测参数等因素，解决目前对这类物质检测存在着的一些关键技术问题。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
>[0006]一种人血浆中色氨酸及其代谢产物检测方法，其先向生物样品加入同位素标记的色氨酸及代谢物作为内标，再通过液
‑
液萃取法提取样品混合物中的色氨酸及其代谢物，使用高效液相将样本中的色氨酸及其代谢物分离后，采用内标标准曲线法进行串联质谱分析。
[0007]根据以上方案，使用到的稳定性同位素内标物有9种，分别是犬尿氨酸
‑
d4(L
‑
Kynurenine
‑
d4)，2
‑
吡啶
‑
d4
‑
甲酸(2
‑
Picolinic
‑
d4 Acid)，5
‑
羟基吲哚
‑3‑
乙酸
‑
2,2
‑
d2(5
‑
Hydroxyindole
‑3‑
acetic
‑
2，2
‑
d2 Acid)，3
‑
羟基邻氨基苯甲酸
‑
d3(3
‑
Hydroxyanthranilic Acid
‑
d3)，色胺盐
‑
d4(Tryptamine
‑
d4 Hydrochloride)，褪黑激素
‑
d4(Melatonin
‑
d4)，3
‑
硫酸吲哚酚
‑
d4
‑
钾盐(3
‑
Indoxyl Sulfate
‑
d4 Potassium Salt)，盐酸血清素
‑
d4(Serotonin
‑
d4 Hydrochloride)，吲哚
‑
d7(Indole
‑
d7)。
[0008]根据以上方案，所述的一种人血浆中色氨酸及其代谢产物检测方法包括以下详细步骤：
[0009]步骤S1，配制系列浓度的标准品溶液和内标工作液；
[0010]步骤S2，分别向待测样本和系列浓度的标准品溶液加4倍体积的甲醇乙腈溶液，再分别加入内标工作液，涡旋混合，冰浴中超声处理30min，超声波功率：600W，超声波频率
40KHZ；
[0011]步骤S3，取纯甲醇过HLB板，采用正压过滤，弃滤液；再取提取液过HLB板，采用正压过滤，弃滤液；
[0012]步骤S4，取步骤S2中获得的各待测样本和标准品，经14000rcf 4℃离心15min，再过经步骤S3处理的HLB板，收集滤液并冷冻干燥，得冻干粉末备用；
[0013]步骤S5，取步骤S4中获得的冻干粉末用含1％甲酸的40％甲醇溶液复溶，涡旋混匀，14000rcf 4℃离心15min，离心后取上清液上样进行LC
‑
MS/MS分析。
[0014]根据以上方案，所述的步骤S2中的甲醇乙腈溶液的比例是甲醇：乙腈＝1：1；所述的步骤S3中的提取液是各组分体积比为水/甲醇/乙腈＝1:2:2的溶液。
[0015]根据以上方案，所述的步骤S4中，最后获得的冻干粉末采用
‑
80℃保存。
[0016]根据以上方案，所述的液相色谱的条件如下：
[0017]流动相：A相：20mM甲酸铵+0.2％FA水溶液(称取630mg甲酸铵溶于500mL纯水中)，加入0.2％甲酸溶液(约加入1mL甲酸)，室温保存，有效期5天；B相：0.2％FA甲醇溶液(量取500mL甲醇溶液，加入1mL甲酸)，室温保存，有效期30天。
[0018]洗脱梯度(A相+B相＝100％)：
[0019]0‑
2min，B相维持在15％；
[0020]2‑
9min，B相从15％线性变化至98％；
[0021]9‑
11min，B相维持在98％；
[0022]11
‑
11.5min，B相从98％线性变化至15％；
[0023]11.5
‑
14min，B相维持在15％；
[0024]流速：400μL/min；柱温：40℃；进样量：5μL。
[0025]根据以上方案，所述的质谱条件如下：
[0026]ESI源离子源温度(Temperature(TEM))：450℃；离子源雾化气(Ion Source Gas1(GS1))：45psi；离子源加热辅助气(Ion Source Gas2(GS2))：45psi；气帘气(Curtain Gas(CUR))：40psi；喷雾毛细管电压(IonSpray Voltage(IS))：4500V(
‑
4500V)；APCI源离子源温度(Temperature(TEM))：550℃；离子源雾化气(Ion Source Gas1(GS1))：50psi；离子源加热辅助气(Ion Source Gas2(GS2))：0psi；气帘气(Curtain Gas(CUR))：40psi；喷雾毛细管电压(IonSpray Voltage(IS))：4500V。
[0027]本专利技术的有益效果是：
[0028]1、本专利技术提供的方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理方法简单。
[0029]2、对体液类样本只需要简单的液液萃取就可以完成样本的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人血浆中色氨酸及其代谢产物检测方法，其特征在于，其先向生物样品加入同位素标记的色氨酸及代谢物作为内标，再通过液
‑
液萃取法提取样品混合物中的色氨酸及其代谢物，使用高效液相将样本中的色氨酸及其代谢物分离后，采用内标标准曲线法进行串联质谱分析。2.根据权利要求1所述的一种人血浆中色氨酸及其代谢产物检测方法，其特征在于，使用到的稳定性同位素内标物有9种，分别是犬尿氨酸
‑
d4、2
‑
吡啶
‑
d4
‑
甲酸、5
‑
羟基吲哚
‑3‑
乙酸
‑
2,2
‑
d2、3
‑
羟基邻氨基苯甲酸
‑
d3、色胺盐
‑
d4、褪黑激素
‑
d4、3
‑
硫酸吲哚酚
‑
d4
‑
钾盐、盐酸血清素
‑
d4和吲哚
‑
d7。3.根据权利要求2所述的一种人血浆中色氨酸及其代谢产物检测方法，其特征在于，其包括以下详细步骤：步骤S1，配制系列浓度的标准品溶液和内标工作液；步骤S2，分别向待测样本和系列浓度的标准品溶液加4倍体积的甲醇乙腈溶液，再分别加入内标工作液，涡旋混合，冰浴中超声处理30min，超声波功率：600W，超声波频率40KHZ；步骤S3，取纯甲醇过HLB板，采用正压过滤，弃滤液；再取提取液过HLB板，采用正压过滤，弃滤液；步骤S4，取步骤S2中获得的各待测样本和标准品，经14000rcf 4℃离心15min，再过经步骤S3处理的HLB板，收集滤液并冷冻干燥，得冻干粉末备用；步骤S5，取步骤S4中获得的冻干粉末用含1％甲酸的40％甲醇溶液复溶，涡旋混匀，14000...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈薇，苗迎玉，
申请(专利权)人：中科新生命浙江生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：