一种基于SF的修饰蛋白质组学分析方法技术

本发明专利技术提供一种基于SF的修饰蛋白质组学分析方法，属于生物技术检测领域，其在样本蛋白提取的过程中使用可酸性条件下分解的表面活性剂，进行蛋白提取，继而对提取的蛋白进行液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种基于SF的修饰蛋白质组学分析方法


[0001]本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于SF蛋白酶解表面活性剂样本制备酶解的修饰蛋白质组学分析方法。

技术介绍

[0002]国际人类蛋白质组计划(HPP)到CNHPP中国人类蛋白质组计划。随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究早已进入后基因组时代。在这个时代，更加着重关注基因的功能和结构。针对目前应用最广的bottom
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up蛋白质组技术。基本流程：样本蛋白制备—定量酶解—脱盐冻干—数据采集—数据分析。因此，蛋白质酶解在蛋白质组学研究中是极为重要的一环，直接影响后期的数据质量。
[0003]常用的蛋白酶解方法有溶液内酶解和filter
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aidedsamplepreparation(简写为fasp)，其中溶液内酶切对蛋白溶液成分有限制，常见的变性剂(例如sds,尿素，盐酸胍)均会影响胰蛋白酶活性从而影响酶解效果；而fasp酶解步骤繁琐，耗时长，工作量比较大，对于样本量少的样本有限制。

技术实现思路

[0004]基于现有技术中存在上述问题，本专利技术提供一种基于SF的修饰蛋白质组学分析方法，其在样本蛋白提取的过程中使用可酸性条件下分解的表面活性剂，进行蛋白提取，继而对提取的蛋白进行液相色谱
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串联质谱分析，具有肽段回收率高，样品重复性好、高通量和可实现自动化的优点。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]一种基于SF的修饰蛋白质组学分析方法，其先通过磷酸盐缓冲盐溶液清洗并收集细胞，再向细胞中添加可在酸性条件下分解的SF蛋白酶解表面活性剂，继而对细胞进行破碎提取细胞内蛋白，提取完成后对SF蛋白酶解表面活性剂进行分解，最后使用液相色谱
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串联质谱对提取到的蛋白质进行分析。
[0007]根据以上方案，所述的一种基于SF的修饰蛋白质组学分析方法包括以下详细步骤：
[0008]步骤S1，将细胞培养容器内的培养基上清液吸除，再向培养容器内添加磷酸盐缓冲盐溶液轻轻晃动培养容器，除去上清液后再次添加磷酸盐缓冲盐溶液进行晃动清洗，最后除去上清液；
[0009]步骤S2，使用细胞刮刀从培养容器内刮取细胞，并向获得的细胞中加入SF蛋白酶解表面活性剂，SF蛋白酶解表面活性剂的终浓度是20％；
[0010]步骤S3，对步骤S2中获得的细胞样本进行破碎，破碎后离心，取上清液，即为待测蛋白样本；
[0011]步骤S4，取待测蛋白样本依次进行还原处理和烷基化处理；
[0012]步骤S5，烷基化处理后加入NH4HCO3溶液，使SF蛋白酶解表面活性剂在混合物中的
浓度降低至2％；
[0013]步骤S6，对待测蛋白样本进行酶解，酶解完成后加入TFA酸化至pH<3；
[0014]步骤S7，对步骤S6最终获得的混合物进行冷冻干燥，并用FA复溶，测OD值，继而上样进行液相色谱
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串联质谱检测分析。
[0015]根据以上方案，所述的步骤S3中对细胞采用超声破碎，使用超声破碎仪，设定功率为80W，超声时间为10S，间歇时间为15S，工作次数为10次；细胞破碎后，采用25℃20000g离心20min，取上清。
[0016]根据以上方案，所述的步骤S4还包括步骤S41，采用BCA定量法对步骤S2中获得的待测蛋白样本进行定量分析。
[0017]根据以上方案，所述的步骤S4中的还原处理是向待测蛋白样本中加入二硫苏糖醇(DTT)，800rpm震荡，室温孵育1h；烷基化处理是加入碘乙酰胺(IAA)，800rpm震荡，避光室温孵育15min。
[0018]根据以上方案，所述的步骤S6中酶解是先加入胞内蛋白酶(Lys
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C)，800rpm震荡1min，37℃孵育2h；再加入胰蛋白酶，37℃，反应8h。
[0019]根据以上方案，所述的步骤S7中，液相色谱的条件是：
[0020]色谱分析柱为25cm*75μm，填料c18为1.9um；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸乙腈水溶液，乙腈浓度为84％；流动相A+流动相B＝100％；流速：300nl/min；液相分离梯度如下：
[0021]0min—70min，b相线性梯度从2％到22％；
[0022]70min—78min，b相线性梯度从22％到37％；
[0023]78min—83min，b相线性梯度从37％到95％；
[0024]83min—90min，b相线性梯度从95％维持至90min。
[0025]根据以上方案，所述的步骤S7中，质谱的条件是：采用正离子扫描模式，分析时长：90min，母离子扫描范围：100
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1700m/z,累积时间100ms，离子迁移率从0.6到1.6Vs/cm2，采集单次循环时间1.16s，DIA模式。
[0026]本专利技术的有益效果是：将SF试剂应用于修饰蛋白质组学的样品制备中，为蛋白样品制备提供新的制备方法，且该方法提取的蛋白在溶液内酶解的过程中肽段回收率，样品重复性等评价指标上均不逊于传统的蛋白质酶解方法，同时使得酶解操作可实现自动化，提高通量。
附图说明
[0027]图1是实施例中三组实验重复鉴定的蛋白、肽段和修饰位点数目结果图；
[0028]图2是实施例中三组实验重复鉴定蛋白的venn图。
[0029]图3：实施例中三组实验重复正离子模式TIC图，是实施例中的结果展示，会根据每一次检测分析的结果发生变化，即图中文字与能否重复实施本专利技术提供的检测方法无关，图中文字不清晰不影响本领域技术人员重复实施本专利技术提供的检测方法。
具体实施方式
[0030]下面结合具体实施例和附图对本专利技术的技术方案进行说明。
[0031]一种基于SF的修饰蛋白质组学分析方法，其先通过磷酸盐缓冲盐溶液清洗并收集细胞，再向细胞中添加可在酸性条件下分解的SF蛋白酶解表面活性剂，继而对细胞进行破碎提取细胞内蛋白，提取完成后对SF蛋白酶解表面活性剂进行分解，最后使用液相色谱
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串联质谱对提取到的蛋白质进行分析，包括以下详细步骤：
[0032]步骤S1，将细胞培养容器(可以是直径10cm的培养皿、六孔板或者96孔板)内的培养基上清液吸除，再向培养容器内添加0.5ml预冷的磷酸盐缓冲盐溶液轻轻晃动培养容器至液面覆盖培养皿表面，除去上清液后再次添加预冷的磷酸盐缓冲盐溶液进行晃动清洗，最后除去上清液。
[0033]步骤S2，使用细胞刮刀从培养容器内刮取细胞加入到1.5ml离心管中，并向获得的细胞中加入SF蛋白酶解表面活性剂，SF蛋白酶解表面活性剂的终浓度是20％。
[0034]步骤S3，对步骤S2中获得的细胞采用超声破碎，首先开启超声破碎仪电源，设定功率为80W，超声时间为10S，间歇时间为15S，工作次数为10次，用酒精润洗超声探头，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于SF的修饰蛋白质组学分析方法，其特征在于，其先通过磷酸盐缓冲盐溶液清洗并收集细胞，再向细胞中添加可在酸性条件下分解的SF蛋白酶解表面活性剂，继而对细胞进行破碎提取细胞内蛋白，提取完成后对SF蛋白酶解表面活性剂进行分解，最后使用液相色谱
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串联质谱对提取到的蛋白质进行分析。2.根据权利要求1所述的一种基于SF的修饰蛋白质组学分析方法，其特征在于，其包括以下详细步骤：步骤S1，将细胞培养容器内的培养基上清液吸除，再向培养容器内添加磷酸盐缓冲盐溶液轻轻晃动培养容器，除去上清液后再次添加磷酸盐缓冲盐溶液进行晃动清洗，最后除去上清液；步骤S2，使用细胞刮刀从培养容器内刮取细胞，并向获得的细胞中加入SF蛋白酶解表面活性剂，SF蛋白酶解表面活性剂的终浓度是20％；步骤S3，对步骤S2中获得的细胞样本进行破碎，破碎后离心，取上清液，即为待测蛋白样本；步骤S4，取待测蛋白样本依次进行还原处理和烷基化处理；步骤S5，烷基化处理后加入NH4HCO3溶液，使SF蛋白酶解表面活性剂在混合物中的浓度降低至2％；步骤S6，对待测蛋白样本进行酶解，酶解完成后加入TFA酸化至pH<3；步骤S7，对步骤S6最终获得的混合物进行冷冻干燥，并用FA复溶，测OD值，继而上样进行液相色谱
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串联质谱检测分析。3.根据权利要求2所述的一种基于SF的修饰蛋白质组学分析方法，其特征在于，所述的步骤S3中对细胞采用超声破碎，使用超声破碎仪，设定功率为80W，超声时间为10S，间歇时间为15S，工作次数为10次；细胞破碎后，采用25℃20000g离心20min，取上清。4.根据权利要求3所述的一种基...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈薇，曾秋芳，庞悦涵，
申请(专利权)人：中科新生命浙江生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：