荧光定量PCR试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法技术方案

本发明专利技术提供一种荧光定量PCR试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法，所述增敏荧光定量PCR试剂盒包括引物，以及两条以上的荧光探针，其中所述两条以上的荧光探针均具有与PCR模板互补的结合位点，在每一轮PCR过程中，扩增的一个DNA分子对应多个荧光信号的产生，从而提高了对样本的检测灵敏度。了对样本的检测灵敏度。了对样本的检测灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
ID NO.2所示的核苷酸序列或其互补链，所述SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的荧光探针可以互补结合于SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或其互补链。
[0010]在一些实施方式中，所述荧光探针为TaqMan探针，所述TaqMan探针的发光基团可以为FAM、HEX、JOE、VIC、TET、ROX、Texas
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Red、CY5或CY3中的一种或多种；所述TaqMan探针的猝灭基团可以为TAMRA、BHQ、DABCYL、MGB或ECLIPSE中的一种或多种。
[0011]在一些实施例中，所述单链DNA可以由本领域已知的方法来获得，例如：亚硫酸氢盐转化法、氧化
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亚硫酸盐转化法、蛋白或抗体富集法、限制性内切酶法或酶促反应法。其中，所述亚硫酸氢盐可以为重亚硫酸氢盐。
[0012]第二方面，本申请提供一种以上第一方面所述的荧光定量PCR试剂盒在制备基因检测试剂中的应用，例如在制备SDC2基因甲基化检测试剂中的应用。
[0013]第三方面，本申请还提供一种荧光定量PCR系统，包括：
[0014]模板、引物及两条以上的荧光探针，其中所述两条以上的荧光探针均具有与所述模板互补的结合位点。
[0015]在一些实施例中，所述模板含两条互补或反向互补核苷酸链的双链DNA分子或者单链DNA，所述两条以上的荧光探针可以互补结合于所述模板中的同一条或不同的核苷酸链。
[0016]第四方面，本申请提供一种核酸定量检测方法，是采用第一方面中所述的荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR检测，或者是采用第三方面中所述荧光定量PCR系统。
[0017]有益效果：本专利技术通过提供一种荧光定量PCR试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法，所述荧光定量PCR试剂盒包括引物，以及两条以上的荧光探针，其中所述两条以上的荧光探针均具有与PCR模板互补的结合位点，通过在每一轮PCR过程中，新产生一个DNA分子对应着多个荧光信号的产生。突破现有技术中，一条模板对应一对引物，以及一条荧光探针，在每一轮PCR过程中，新产生一个DNA分子只对应着一个荧光信号的产生的问题。从而提高了对样本的检测灵敏度。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0019]图1是现有的荧光定量PCR反应系统的原理示意图；
[0020]图2是本专利技术实施例提供的一个敏荧光定量PCR反应系统的原理示意图；
[0021]图3是本专利技术实施例提供的又一个敏荧光定量PCR反应系统的原理示意图；
[0022]图4是本专利技术实施例中实施例1提供的阳性对照、系统3、系统1、系统2和阴性对照的PCR扩增曲线图；
[0023]图5是本专利技术实施例中实施例2提供的阳性对照、系统6、系统4、系统5和阴性对照的PCR扩增曲线图；
[0024]图6是本专利技术实施例中实施例3提供的阳性对照、系统9、系统8、系统7和阴性对照的荧光值的差值PCR扩增曲线图。
具体实施方式
[0025]术语定义与说明
[0026]术语“PCR”或“PCR扩增”是指聚合酶链反应。
[0027]术语“引物”是指够在PCR反应中充当DNA复制反应起始子的寡核苷酸DNA。
[0028]术语“荧光探针”是指具有荧光标签的寡核苷酸，所述荧光标签能够改变荧光强度。本领域技术人员可以理解，本专利技术中荧光探针可以是本领域已知的任何用于PCR定量的荧光标记分子，只要其和靶序列(PCR模板)可以发生特异性结合并因此发生荧光强度的变化，进而显示靶序列中特定片段的数量即可实现本专利技术的目的。在一些实施方式中，所述荧光探针为TaqMan探针、TaqMan
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MGB探针、分子信标探针(Molecular Beacons)、荧光能量共振转移探针(又称Light Cycler探针)、置换探针、UT探针、蝎子引物(Scorpions)、LUX引物(Invitrogen)和Amplifier引物或双环探针中的一种或多种。在一些实施方式中，所述荧光探针可以为依赖聚合酶5
′→3′
外切核酸活性的探针，例如，TaqMan探针；也可以为不依赖聚合酶5
′→3′
外切核酸活性的探针，例如分子信标探针和置换探针。
[0029]术语“核苷酸”应当在本文中理解为除了指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸之外，还指相对于正在使用的核苷酸的特定上下文(例如，杂交至互补碱基)，在功能上等同的其相关的结构变体，包括衍生物和类似物。
[0030]本专利技术中，“DNA甲基化”是一种表观修饰，它是在不改变碱基序列的情况下，对基因表达进行调控，所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。在一个实施方案中，可以采用亚硫酸氢盐转化的方法来区分甲基化和未甲基化的胞嘧啶(C)，亚硫酸氢盐转化过程包括变性、脱氨基和脱磺酸基，通过变性过程，DNA双链变成两条单链，通过脱氨基和脱磺酸基过程，未甲基化的胞嘧啶(C)被转化成尿嘧啶(U)，在后续的PCR过程中进一步转变成胸腺嘧啶(T)，而甲基化的胞嘧啶(C)保持不变。经过以上步骤，原本互补的两条DNA链(正义链和反义链)被转化成两条完全不互补的两条DNA单链。在本专利技术实施例中，术语“C
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T转化”指的是DNA分子序列中的胞嘧啶(C)为胸腺嘧啶(T)置换，属于碱基转换的一种类型。
[0031]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0032]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
[0033]除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
[0034]本专利技术实施例中涉及的引物和荧光探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0035]本专利技术实施例中涉及的HA Buffer、probe buffer、dNTP、Taq酶和纯化水均购置于
天根生化科技(北京)有限公司。
[0036]本专利技术实施例中涉及的试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit购自于Qiagen公司，试剂盒EZ DNA Meth本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括引物，以及两条以上的荧光探针，其中所述两条以上的荧光探针均具有与PCR模板互补的结合位点。2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR模板为含两条互补或反向互补核苷酸链的双链DNA，所述两条以上的荧光探针互补结合于所述双链DNA中的同一条或不同的核苷酸链。3.根据权利要求1所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR模板为单链DNA；优选的，所述单链DNA为双链DNA经转化得到的两条不互补的核苷酸单链，所述引物包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对和第二引物对能够分别扩增所述两条不互补的核苷酸链生成互补链。4.根据权利要求3所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述两条以上的荧光探针互补结合于所述单链DNA或其互补链中的同一条或不同的核苷酸链。5.根据权利要求4所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述两条不互补的核苷酸单链分别包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；所述第一引物对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述第二引物对如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；所述荧光探针包括如SEQ ID NO.7、SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张良禄，董兰兰，李婷婷，
申请(专利权)人：武汉艾米森生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：