一种绝对定量细胞内DNA双链断裂数量的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种绝对定量细胞内DNA双链断裂数量的方法及应用。该方法将带有末端修饰的外源核苷酸片段插入至固定细胞基因组DNA双链断裂处，然后将基因组片段化并连接衔接接头，针对外源核苷酸片段和衔接接头设计特异性PCR引物和特异性荧光探针，结合细胞内参基因，构建数字液滴PCR体系，定量细胞内DNA双链断裂数量。本发明专利技术使得检测DNA双链断裂摆脱了序列依赖性，广泛适用于绝对精准定量动植物内因疾病、辐射、药物或者基因编辑等各种原因造成的DNA双链断裂数量，可用作检测射线损伤、化学药物损伤、基因编辑脱靶效率等问题的有效工具，在分子生物学和临床诊断中具有非常广阔的应用前景。用前景。用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种绝对定量细胞内DNA双链断裂数量的方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种基于数字液滴PCR检测细胞内DNA双链断裂(DSB)数量的方法及其应用。

技术介绍

[0002]DNA双链断裂(DSB)是存在于细胞内染色质中的一种常见的DNA损伤，其表现为DNA双螺旋结构中两条互补链于同一对互补脱氧核苷酸处同时断裂。造成DSB损伤的原因主要来源于三个方面：物理因素、化学因素、生物因素。肿瘤放疗过程产生的物理射线会直接打断DNA双链；某些生物代谢物和化学试剂也会诱导DSB；生物基因编辑技术如CRISPR/Cas9也会非特异性的切割DNA造成DSB。机体内DSB数量累计过多会破坏遗传物质的稳定性，加重机体修复功能负荷，对生物体造成不可逆的伤害甚至死亡。因此，开发一种方法能方便快捷的定量细胞中DSB数量是非常有必要的。
[0003]目前，PCR、qPCR和高通量测序是检测细胞内DSB的常用方法，但是这三种方法都有不同程度的缺陷。基于PCR的方法是将一段带有5
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磷酸化修饰和两端硫代磷酸修饰的外源DNA片段原位插入到特定单一DSB处，在DSB位点上下游基因组和外源DNA片段上分别设计特异性引物，通过PCR扩增然后检测目的条带判断此位点是否为DSB，这种方法十分受限于位点序列信息，只能用于已知位点的检测，而且通量低，时间成本大。qPCR检测DSB的方法基于组间染料强度来相对定量，不能绝对定量体系中的DSB数量。高通量测序是将一端外源DNA片段修复至DSB处，通过将基因组片段化后一端加上测序接头，针对测序接头设计特异性引物，进行高通量测序鉴定DSB的数量和序列信息，这虽然可以准确获得DSB的数量和序列信息，但是实验周期很长，测序建库质量控制得不到保障，实验成本巨大。因此，上述三种方法均不适合于快速定量基因组中所有类型的DNA双链断裂。
[0004]数字液滴PCR(ddPCR)是近些年来发展出来的第三代PCR技术，数字液滴PCR是基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量方法，且是绝对定量的方法。数字液滴PCR目前主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个，这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。
[0005]但是，现有的利用数字液滴PCR检测DNA双链断裂的研究多数针对特定基因位点的基因编辑效率，但是不能检测基因组中存在的所有DSB数量，也不能摆脱检测位点的序列依赖性，这大大制约了DSB检测效率。因此，便于提高检测基因编辑效率和方便临床DNA损伤评估，本领域迫切需要开发一种囊括基因组所有类别DNA双链断裂类型且具有序列非依赖性的DNA双链断裂绝对定量方法。

技术实现思路

[0006]为了弥补上述不足，本专利技术提供了一种快速、非序列依赖性绝对定量基因组中DNA
双链断裂数目的方法。该方法进一步拓展了ddPCR在检测基因组DSB数量上的应用范围，用来实现绝对定量由任何原因产生的DNA双链断裂数目，可以广泛的用于基因组问题和临床诊断中对DNA双链断裂事件的评估，但不限制DNA双链断裂的产生原因，本专利技术中该方法也被称为TD
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PCR(DSB
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digital
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droplet PCR)法。具体技术方案如下：
[0007]一种新的基因组DNA双链断裂绝对定量方法，包括由任意过程产生的DNA双链断裂，断裂处经末端修复后，将外源核苷酸片段(dsODN)原位连接到固定细胞基因组DNA双链断裂处的两侧，随后将基因组DNA片段化，末端修复后在所有片段未连接dsODN的端头连上衔接接头(adapter)并纯化回收；针对外源核苷酸片段和衔接接头分别设计特异性扩增引物用于扩增基因组DNA片段，并针对外源核苷酸片段设计特异性荧光探针，以及针对一个内源参考基因(简称内参基因)设计特异性扩增引物对和内源参考基因特异性探针，使得DNA双链断裂事件仅通过数字液滴PCR就能被绝对定量。
[0008]为了验证本专利技术绝对定量细胞内DNA双链断裂数量方法的有效性，首先利用DNA双链断裂产生工具在细胞基因组中制造不同剂量的DNA双链断裂。在本专利技术的两个实施例中分别通过核酸酶Cas9、espCas9、XCas9和化学药品依托泊苷产生DNA双链断裂。实施例1中依托泊苷经稀释加入细胞培养基使用，终浓度选择为0μM，10μM和150μM。实施例2中核酸酶序列均与靶向sgRNA整合进同一个px330载体，并经转染进入细胞。但本专利技术不限制任何产生DNA双链断裂的方法。
[0009]其中，所有断裂处末端修复可以兼容1ng～1μg片段化Input DNA，可实现片段化DNA的末端补平、5'端磷酸化和3'端加A尾反应，得到5'末端含磷酸基团且3'末端带有dA突出的DNA产物，从而能够和外源核苷酸片段或衔接接头连接。
[0010]其中，所述外源核苷酸片段为专利技术人根据退火温度、GC含量等信息人工设计的，由长度在40
‑
80bp之间的互补的DNA双链组成，所述外源核苷酸双链由体外化学法合成，由正反两条互补的单链经退火后形成最终双链核苷酸序列。所述外源核苷酸片段的正义链5'和3'端末位核苷酸均含有磷酸化修饰，外源核苷酸片段反义互补链的3'端末位含有硫代磷酸修饰。所述外源核苷酸序列经与待测基因组序列比对没有同源性。
[0011]其中，所述衔接接头为一个长度为10～60bp的双链核苷酸片段，其中正义链3'端含有硫代磷酸修饰，反义互补链的5'端末位核苷酸含有磷酸化修饰，由正反两条互补的单链经退火后形成最终双链衔接接头。
[0012]在本专利技术的实施例中，所述外源核苷酸片段特异性荧光检测探针长度在15～25nt之间，5'端连有HEX荧光基团，3'端连有MGB淬灭基团。内参基因特异性荧光检测探针长度在15～25nt之间，5'端连有Cy5荧光基团，3'端连有MGB淬灭基团。外源核苷酸片段特异性荧光检测探针和内参基因特异性荧光检测探针均为专利技术人设计且体外化学合成。但是本方法在荧光基团互不干扰的情况下不限制荧光基团和淬灭基团的选择。
[0013]其中，所述外源核苷酸片段连接到DNA双链断裂缺口两端的过程和将衔接接头连接到基因组DNA片段两端的过程均通过T4连接酶完成。
[0014]在本专利技术的实施例中，所述基因组片段化方法为超声片段化法，最终得到的基因组DNA片段长度为200～650bp之间的双链DNA，片段大小详见图2中A。但本专利技术不限制任何基因组片段化方法。
[0015]在本专利技术的实施例中，所述纯化回收是利用纯化磁珠将指定长度的DNA片段纯化
出来，其可选的纯化的DNA片段长度范围是：250
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350bp、320
‑
420bp、450
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550bp、550
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700bp、700
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种绝对定量细胞内DNA双链断裂数量的方法，包括以下步骤：1)进行细胞原位DNA双链断裂末端修复，然后连接外源核苷酸片段，所述外源核苷酸片段为双链核苷酸片段，其正义链5'和3'端末位核苷酸均含有磷酸化修饰，反义互补链的3'端含有硫代磷酸修饰；2)提取并纯化细胞基因组DNA，然后进行超声片段化，对得到的基因组DNA片段末端修复后连接衔接接头，所述衔接接头为双链核苷酸片段，其正义链3'端含有硫代磷酸修饰，反义互补链5'端末位核苷酸含有磷酸化修饰；3)纯化并回收选定长度范围内的基因组DNA片段；4)以外源核苷酸片段特异性荧光探针为检测信号，采用外源核苷酸片段特异性扩增引物以及衔接接头特异性扩增引物进行ddPCR，同时以内源参考基因特异性扩增引物和内源参考基因特异性荧光探针进行ddPCR；5)识别具有外源核苷酸片段特异性探针荧光信号的阳性液滴和具有内源参考基因特异性探针荧光信号的阳性液滴，统计它们的数量，经计算处理得到细胞中DNA双链断裂的绝对数量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述外源核苷酸片段的长度为40～80bp。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述外源核苷酸片段的正义链序列为：5'
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PHO
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GCTCGCGTTTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGTATACGCGA
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PHO
‑
3'，反义互补链序列为：5'
‑
TCGCGTATACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAAACGCGAGC*T
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3'，其中“PHO”表示磷酸化修饰，“*”表示硫代磷酸酯键；步骤4)中所述外源核苷酸片段特异性荧光探针序列为：5'
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CTCGCGTTTAATTGAGTTGTC
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3'，其5'端连有荧光基团，3'端连有淬灭基团。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛佳浩，王尧，孙育杰，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：