一种通用发夹引物及在检测microRNA中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种通用发夹引物，发夹结构的3

【技术实现步骤摘要】
一种通用发夹引物及在检测microRNA中的应用
[0001]
：本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种通用发夹引物，基于该通用发夹引物的组合物，基于该引物检测microRNA的方法和该引物的应用。
[0002]技术背景：microRNA（microRNAs）是单链、约22个核苷酸（nt）的非编码RNA，是许多关键细胞过程的重要调节因子，包括凋亡、增殖或分化，microRNAs的失调可能导致人类疾病的发展，如癌症和其他慢性和代谢性疾病。鉴于microRNA在不同细胞和组织中的表达水平存在显著差异，准确的microRNA定量对于评估microRNA的生物学功能和可能的致病作用至关重要。
[0003]microRNA检测方法可分为以下几类：1）常规技术，如Northern印迹、微阵列、原位杂交和定量逆转录（RT）PCR（RT
‑
qPCR）；2）生物传感器技术，如基于电化学的检测、基于光学的检测和基于纳米管的技术；3）其他新兴技术，包括下一代测序（NGS）和核酸扩增技术，如滚环扩增（RCA）、基于双链特异核酸酶（DSN）的扩增、环介导等温扩增（LAMP）、指数扩增反应（EXPAR）和链置换扩增（SDA）。尽管有许多microRNA定量技术可用，但对12个商业平台的分析显示，平台内和/或平台间的重复性、敏感性、准确性、特异性和一致性存在很大差异。
[0004]定量
‑
逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT
‑
PCR）是目前检测低表达水平microRNA的主要方法之一。该方法首先将microRNA逆转录成相应的cDNA，然后以cDNA为模板进行定量PCR（quantitative transcription PCR, qPCR），实时检测扩增产物的数量，间接实现microRNA的定量分析。qRT
‑
PCR具有灵敏度高、特异性强、简便快速、成本低等突出优点，常用于microRNA表达谱分析以及Northern blotting和微列阵法等其他方法检测结果的进一步验证和确认。由于成熟microRNA序列短，缺少poly（A）尾，以及在microRNA样品制备过程中易夹杂少许pri
‑
microRNA或pre
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microRNA等，导致传统的qRT
‑
PCR检测法无法满足microRNA定量分析的需求。为解决这些问题，传统RT
‑
PCR方法被进行了多方面的升级改造：茎环引物RT
‑
PCR、引物延伸RT
‑
PCR、poly（A）加尾RT
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PCR和探针法RT
‑
PCR等。
[0005]茎环引物RT
‑
PCR中的茎环引物的序列一般由3个功能部分组成，即与microRNA的3
’
端互补的单链部分、双链部分（茎）和通用引物结合序列的环结构部分。茎环引物有6个核苷酸（nt）与microRNA互补，结合的特异性强，一旦MsHP对靶向microRNA进行退火，进行逆转录反应，并将所得cDNA产物用作实时定量PCR的模板。使用与成熟microRNA匹配的正向引物和与发夹或茎环结构的3'端互补的反向引物进行分析。现有技术中茎环引物设计难度相对较大，茎环单链环状区较长，具有一个十几至几十nt，形成的条件较为苛刻，引物制作和检测费用高，茎环引物RT
‑
PCR所需RNA样品用量大，检测时间长，效率低，无法实现高通量检测。有报道在茎环引物的3
′
端引入八个简并碱基，采用该“通用茎环引物”进行逆转录，发现八聚体茎环引物对microRNA检测的灵敏度明显低于miRNA特异性发夹引物（Yang LH et al. Universal stem
‑
loop primer method for screening and quantification of microRNA. PLoS One. 2014; 9, e115293）。专利201711433279.2公开了一种用于
miRNA定量的改进型通用茎环引物及其定量方法，在之前报道的通用型茎环引物基础上改变了茎环结构的序列，提供了一种具有八个简并碱基的茎环引物，但未与miRNA特异性发夹引物进行比较，无法评估该方法对microRNA真实表达水平的检测效果。
[0006]
技术实现思路
：为了解决检测microRNA的现有技术中茎环引物需要针对待检测的microRNA设计特异性发夹引物、费时费力、成本效率低，以及通用茎环引物检测效率低的问题，本专利技术提供了一种通用发夹引物及在检测microRNA中的应用。
[0007]本专利技术的目的是通过以下措施实现的：本专利技术提供的通用发夹引物（universal hairpin primer, UHP），包含从5
’
到3
’
依次的成发夹序列、环序列、互补发夹序列，其特征在于：互补发夹序列的3
’
端连接有2
‑
6个随机碱基序列。所述随机碱基序列可以为（A/C/G/T）（A/C/G/T）或（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）或（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）或（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）或（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T），所述随机碱基序列用于与DNA或RNA模板结合，所述模板包括但不限于基因组DNA、cDNA、质粒DNA、mRNA、microRNA、LncRNA、CircRNA。3
’
端连接2个、3个、4个、5个、6个随机碱基序列的通用发夹引物分别命名为UHP2、UHP3、UHP4、UHP5、UHP6。
[0008]优选的，上述通用发夹引物，从5
’
到3
’
依次的成发夹序列、环序列、互补发夹序列，为SEQ No.1。
[0009]优选的，上述通用发夹引物为包含至少两种UHP的通用发夹引物组合物组合物。
[0010]优选的，上述通用发夹引物组合物为UHP2：UHP4：UHP6以摩尔比8：1：1混合。
[0011]本专利技术还提供了上述通用发夹引物或通用发夹引物组合物在检测microRNA中的应用。
[0012]本专利技术还提供了一种检测microRNA的方法，包含以下步骤：一种检测microRNA的方法，包含以下步骤：步骤1，获得RNA模板：细胞中提取总RNA，纯化获得<200nt的小RNA，进行定量及纯度检测；步骤2，获得RNA/通用发夹引物混合物：将总RNA与上述通用发夹引物混合于ddH2O中，或者，将纯化小RNA 与上述通用发夹引物混合于ddH2O中，或者，将总RNA与本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通用发夹引物，包含从5
’
到3
’
依次的成发夹序列、环序列、互补发夹序列，其特征在于：互补发夹序列的3
’
端连接有2
‑
6个随机碱基序列，所述的2
‑
6个随机碱基序列用于与模板结合。2.如权利要求1所述的通用发夹引物，其特征在于：所述从5
’
到3
’
依次的成发夹序列、环序列、互补发夹序列，为SEQ No1。3.一种通用发夹引物组合物，其特征在于：包含如权利要求1或2所述的至少两种连接有不同数量随机碱基序列的通用发夹引物。4.如权利要求3所述的通用发夹引物组合物，其特征在于：包含分别连接有2个、4个和6个随机碱基序列的三种通用发夹引物，其摩尔比为8：1：1。5.如权利要求1或2所述通用发夹引物，或者，如权利要求3或4所述通用发夹引物组合物在检测microRNA中的应用。6.一种检测microRNA的方法，包含以下步骤：步骤1，获得RNA模板：细胞中提取总RNA，纯化获得<200nt的小RNA，进行定量及纯度检测；步骤2，获得RNA/通用发夹引物混合物：将总RNA或纯化小RNA与权利要求1或2所述通用发夹引物，或权利要求3或4所述通用发夹引物组合物混合于ddH2O中，并在70℃下退火5分钟，在冰上冷却；步骤3，逆转录RNA：在RNA/通用发夹引物混合物中添加RNase抑制剂、10
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反应缓冲液、dNTPs、逆转录酶、补充不含RNase的ddH2O；反应条件：25℃
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【专利技术属性】
技术研发人员：毕杨，范家铭，何通川，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：