诱导MC3T3-E1细胞体外成骨分化的缓释微囊及其制备制造技术

本发明专利技术公开一种诱导MC3T3

【技术实现步骤摘要】
诱导MC3T3
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E1细胞体外成骨分化的缓释微囊及其制备


[0001]本专利技术属于医用材料
，具体涉及一种诱导MC3T3
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E1细胞体外成骨分化的缓释微囊及其制备。

技术介绍

[0002]在自然条件下，骨修复愈合期需要3～6个月，是一个由成骨细胞、破骨细胞以及多种生长因子共同参与的复杂、漫长的过程。成骨细胞(Osteoblast,OB)作为骨形成的主要细胞，负责骨基质的合成、分泌与矿化，是骨细胞(Osteocyte,OS)的直接来源，同时也参与调节破骨细胞(Osteoclast,OC)对骨的吸收。因此，维持OB的数量与活性对骨组织损伤的修复与再生具有重要的意义。
[0003]研究发现骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等多种生长因子对骨缺损的修复有积极作用，而骨形态发生蛋白
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2(bone morphogenetic protein,BMP
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2)位于作用场中心。作为最重要的成骨调控信号分子，BMP
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2在体内通过自分泌和旁分泌形式作用于细胞，经配体与细胞膜表面受体的结合，激活Smads信号传导和调节成骨基因转录而发挥其成骨作用。研究发现，BMP
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2可上调60余种基因表达，其中包括Smad6、Smad7、Msx2等十余种重要的成骨相关转录因子；BMP
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>2对于大多数的骨基质蛋白都有着强烈的增殖和表达效应，并可矿化人成骨细胞，而人初级成骨细胞内ALP活性和PTH反应性的增强以及cAMP产量的提高都是BMP
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2作用的结果，提示BMP
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2对骨痂的形成意义重大。体外实验也已证实BMP
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2在诱导异位成骨、修复骨缺损等方面具有非常显著的作用，目前BMP
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2作为一种稳定的局部诱导骨形成生长因子，被FDA批准允许应用于临床，主要以载体植入缓释、局部注射、基因转染等方式发挥促成骨效应。
[0004]随着中医药现代化的快速发展，以补肾中药制剂作为促进成骨分化的诱导剂来防治疾病的研究逐渐开展，并初见成效，这为研究骨组织的修复及重建提供了新思路。相关方剂的数据挖掘研究显示，淫羊藿因其补肾壮阳、强筋健骨效力尤甚而备受古今大家们的青睐，使用频次颇高，诸多基础研究也证实淫羊藿在增加骨量与骨质量方面具有积极的作用。相关研究发现淫羊藿苷(icariin,ICA)的成骨性能最为突出，ICA能促进BMSCs向成骨细胞方向分化，同时促进成骨细胞增殖、抑制破骨细胞活性、提高成骨细胞活性，增加成骨细胞ALP阳性克隆数和钙化结节、上调成骨细胞特异性转录因子Runx
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2、Osterix等基因表达量，ColⅠ的分泌量也明显增多，表现出巨大的促成骨潜力。
[0005]为了使某些药物或者生长因子能够持久地发挥作用，研究者常对支架材料进行一定的包装加工或者修饰以达到药物缓释的目的。包装加工多采用微球微囊包裹以及水凝胶包被；修饰包括化学修饰及生物学修饰；目前，许多生物相容性良好的高分子材料制备的海绵状多孔支架已广泛应用于骨组织工程的研究中，如聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)等，但材料支架加工常因蛋白质结构破坏导致所载药物失活，且大部分高分子材料都是疏水性材料，与水溶性的BMP
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2、ICA难以兼容。
[0006]海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊技术较为成熟，但聚赖氨酸昂贵的价格、复杂的制备工艺严重限制了其应用；于是与其结构相似的壳聚糖成为聚赖氨酸的理想替代材料，壳聚糖无毒、无刺激性，具有良好的生物相容性，能为细胞生长提供所需的三维支架及类似软骨基质的细胞外环境，目前海藻酸/壳聚糖复合体在骨科修复、结肠给药、微球栓塞、运载基因等领域广泛应用。诸多研究表明，壳聚糖包裹海藻酸钠制备的微囊膜强度高、渗透性可调节，具有良好的生物相容性和pH敏感性，在固定化细胞和药物缓释载体领域显示了极大的潜力，同时具有很好的机械性能，是一种包埋活细胞和控制释放体系的理想载体。
[0007]中国专利CN 103495209 B公开一种自发荧光骨修复磁性缓释微球，其采用溶剂热法合成纳米Fe3O4，将纳米Fe3O4均匀分散于海藻酸钠溶液中，同时复合对成骨细胞具有促进增殖和分化作用的传统中药
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淫羊藿苷；将混合物通过微囊成型装置，滴入凝胶浴中形成初级微球；再将初级微球浸没于壳聚糖溶液中，利用壳聚糖和海藻酸钠的电荷互补特性形成聚电解质半透膜，并将复合微球与京尼平交联，制备自发荧光骨修复磁性缓释微球。所得微球可控制药物淫羊藿苷的释放，可用于治疗和修复骨癌、骨缺损疾病的同时促进新骨组织的生产。该专利主要利用了ICA的药用特性，但从前述内容可知，ICA与BMP均可单独表现出可靠的促成骨特性，单一使用的效果始终是有限的，如能将两者联用并发挥协同增效作用将会带来巨大的社会效益。
[0008]不过考虑到BMP
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2在体内易失活、易降解的问题，如何对微囊结构进行合理设计并有效维持ICA及BMP在局部的持续释放也是亟需重点解决的问题。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种诱导MC3T3
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E1细胞体外成骨分化的缓释微囊及其制备，明确了淫羊藿苷与BMP
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2联合诱导成骨分化的效应及两者间的关系，建立能缓释淫羊藿苷及BMP苯硼酸基海藻酸/壳聚糖微囊，明确淫羊藿苷及BMP缓释促成骨的效应及优势，证实祖国医学“肾主骨生髓”理论的科学性，为中医药联合细胞因子治疗骨修复再生提供了实验室依据。
[0010]本专利技术的技术方案为：一种诱导MC3T3
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E1细胞体外成骨分化的缓释微囊的制备方法，具体包括如下步骤：
[0011](1)Alg接枝PBA的制备
[0012]将海藻酸钠(Alg)溶于去离子水中，再将1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC
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HCl)、1.15g N
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羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入溶液中后活化30min；将氨基苯硼酸(APBA)滴加到上述混合溶液中，搅拌反应后用乙醇沉淀产物，提纯，重复三次，透析后冷冻干燥，得Alg
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PBA。
[0013](2)Alg
‑
PBA
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ICA的制备：配制PBS与DMSO的混合溶剂，将淫羊藿苷(ICA)溶于混合溶剂中；将上步所得Alg
‑
PBA溶于混合溶剂中，将ICA溶液缓慢滴入Alg
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PBA溶液中，室温下搅拌反应，透析，冻干，制得Alg
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PBA
‑
ICA；
[0014](3)SiO2‑
NH2微球的制备：将无本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.诱导MC3T3
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E1细胞体外成骨分化的缓释微囊的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)Alg接枝PBA的制备：将Alg溶于去离子水中，将EDC
·
HCl、NHS加入溶液中，活化后将APBA滴加到溶液中，搅拌反应，用乙醇沉淀产物，提纯，重复三次，透析后冷冻干燥，得Alg
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PBA；(2)Alg
‑
PBA
‑
ICA的制备：配制PBS与DMSO的混合溶剂，将ICA溶于混合溶剂中；将上步所得Alg
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PBA溶于混合溶剂中，将ICA溶液缓慢滴入Alg
‑
PBA溶液中，室温下搅拌，透析，冻干，制得Alg
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PBA
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ICA；(3)SiO2‑
NH2微球的制备：将无水乙醇、蒸馏水、氨水混合均匀，标记为A液；将TEOS和乙醇混合均匀，标记为B液；将B液加入A液中，室温下反应，离心洗涤，真空干燥得到SiO2微球；将制备的SiO2微球样品分散到无水甲苯中，剧烈搅拌下滴加KH550，冷凝回流反应，静置，除去上清液之后用甲苯、乙醇交替离心洗涤，真空干燥得SiO2‑
NH2微球；(4)Alg
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PBA
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ICA囊泡的制备：配制Alg
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PBA
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ICA、CS溶液和SiO2悬浮液，超声，将SiO2悬浮液缓慢滴入Alg
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PBA
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ICA溶液中，吸附反应后用缓冲溶液洗涤，分散至缓冲溶液中，缓慢滴入CS溶液中，吸附反应后用缓冲溶液洗涤，分散至缓冲溶液中，缓慢滴入Alg
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PBA
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ICA溶液中，吸附反应后用缓冲溶液洗涤，再分散至缓冲溶液中，滴入氯化钙溶液交联，用缓冲溶液洗涤并离心，冷冻干燥得到层层自组装的Alg
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PBA
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ICA@SiO2核壳粒子；将Alg
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PBA
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ICA@SiO2核壳粒子加入NH4F/HF缓冲溶液中，超声分散后在室温下搅拌，去离子水洗涤并离心，冷冻干燥得到Al...

【专利技术属性】
技术研发人员：华臻，施冬健，陈继伟，
申请(专利权)人：华臻，
类型：发明
国别省市：