用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物、套组及方法技术

本发明专利技术提供了一种用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物、套组及方法。澄清组成物包含：折射率吻合材料、包含表面活性剂的渗透剂、至少两种染色物质和溶剂。染色方法包括以下步骤：(a)将样本于固定液中固定；(b)将样本包埋于包埋材料中；(c)将被包埋的样本浸置于上述澄清组成物而使得澄清组成物可以渗透被包埋的样本；以及(d)使用封片胶对被包埋的样本进行密封。的样本进行密封。的样本进行密封。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物、套组及方法


[0001]本专利技术主张在公元2019年8月7日所申请的美国临时申请案US62/883,656号作为优先权，并且援引美国临时申请案所有内容。
[0002]本专利技术涉及一种用于生物组织分析领域的组成物和方法，更具体地说，涉及一种用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物、套组及方法。

技术介绍

[0003]在撷取和分析生物组织影像的领域中，共轭焦显微镜比常规广域光学显微镜具有较多优势。例如包含控制景深的能力，消除或减少远离焦距平面的背景信息的能力，以及从厚样本中收集连续光学切片的能力。共轭焦显微镜的基础重点是空间滤波，它可以消除厚度超过焦点所在平面的标本中的离焦光线或眩光。通过共轭焦显微镜，可以获得更佳的次微米荧光生物学影像。
[0004]在正常情况下，组织的厚度限制了光的穿透程度，因为组织的本质在未处理时是不透明的。而克服上述问题的一种方法是将大/厚组织切成较薄的样本，使其适合使用显微镜观察。另一种方法是将组织变透明化，使光可以穿透其本身。在某些情况下，为了通过光学显微镜或共轭焦显微镜观察非透明组织内的目标，需要将其进行预处理。一个典型的预处理被称为澄清化处理(clearing treatment)。基本上，为使用澄清剂使组织本身变得透明。
[0005]美国专利申请：US 2014/0087419 A1(下称「419专利申请」)(Atsushi Miyawaki等人，2012)专利技术了一种使生物材料变透明的方法。419专利申请中提到，在现有技术中，使用有机溶剂作为活性成分或类似物是进行澄清化处理的必要条件。然而，对应的澄清化方法主要仅适用于已固定的样本，但绝大不适用于活体组织。这类方法还具有会造成生物材料萎缩的风险。为了解决上述问题，419专利申请教示了使用尿素来使生物材料变透明。由于尿素具有高生物亲和性(bio
‑
affinity)之特点，因此使用尿素或尿素衍生物作为活性成分进行透明化处理，可解决上述之问题。
[0006]419专利申请中所公开的方法涉及分别用两种渗透溶液浸渍组织样本。此外，第一渗透溶液含有至少一种尿素或尿素衍生物的化合物，第二渗透溶液含有至少一种尿素或尿素衍生物的化合物，并且其浓度高于第一溶液中含有的化合物的浓度。
[0007]WO 2011/111876A1专利申请(下称「876专利申请」)(Atsushi Miyawaki等人，2010)公开了一种用于使生物材料透明的试剂。更具体而言，该试剂含有活性成分和至少一种尿素或尿素衍生物的化合物。依876专利申请，在现有技术中，使用一种称作FocusClear的溶液可使组织样本变透明。然而，由于FocusClear溶液含有二甲基亚砜(DMSO)或类似物(例如，活性成分)，因此其不适用于活体组织。因此，FocusClear溶液主要为用于已固定的样本。此外，FocusClear溶液的成分复杂，故导致制备过程复杂且成本高。FocusClear为强碱性溶液，容易破坏生物标记物。在其他现有技术中，澄清剂的组成必须包含大量的有机溶
剂，因此其几乎破坏了所有的荧光蛋白。其产生结果是很难通过荧光蛋白进行组织观察。
[0008]为了解决上述问题，876专利申请公开了一种使生物材料透明化的澄清剂，该澄清剂包含具有较高生物亲和力的活性成分。简而言之，876专利申请中的澄清剂包含具有至少一种尿素化合物或尿素衍生物的活性组分。然而，876专利申请所公开的方法仍然需较长的处理时间和较高成本的等一些缺陷。

技术实现思路

[0009]本专利技术公开了一种用于使生物材料呈现透明的澄清组成物。该澄清组成物可以随套组(kit)一起提供。澄清组成物包含折射率(Refractive Index；RI)吻合材料、包含表面活性剂的渗透剂、第一染色物质、第二染色物质和溶剂。
[0010]在某些实施例中，其中组成物的pH值为6.5至8.4。
[0011]在某些实施例中，折射率吻合材料包含：放射性对比剂、单醣、寡醣或上述任意的组合。
[0012]在某些实施例中，折射率吻合材料包含：碘克沙醇(iodixanol)、果糖(fructose)、蔗糖(sucrose)或上述任意的组合。
[0013]在某些实施例中，渗透剂包含：清洁剂(detergent)。
[0014]在某些实施例中，表面活性剂不包含任何离子物质。
[0015]在某些实施例中，表面活性剂包含：聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X
‑
100)、吐温
‑
20(Tween
‑
20)、吐温
‑
80(Tween
‑
80)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基
‑
β
‑
D
‑
麦芽糖苷(DDM)、尿素(Urea)、CHAPS、脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate)或上述任意的组合。
[0016]在某些实施例中，表面活性剂选自由Triton X
‑
100和Tween
‑
20所组成的群组。
[0017]在某些实施例中，表面活性剂的临界微胞浓度(CMC)为0.01至0.025。
[0018]在某些实施例中，溶剂包含：磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、双蒸水(ddH2O)或上述的组合。
[0019]在某些实施例中，第一染色物质和第二是选自由促进剂(agonist)、拮抗剂(antagonist)、抗体(antibody)、蛋白质卵白素(avidin)、右旋糖酐(dextran)、脂质核苷酸(lipidnucleotide)或蕈类毒素(phallotoxin)所组成的群组。
[0020]在某些实施例中，第一染色物质包含：4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚(DAPI)、碘化丙啶(Propidium Iodide)、SYTO 16、SYTO 40、NucRed或NucGreen。
[0021]在某些实施例中，第二染色物质包含：亲脂性示踪剂荧光染料(lipophilic tracers fluorescence dye)。
[0022]在某些实施例中，澄清组成物或套组还包含抗冻剂、保湿剂或上述任意的组合。
[0023]在某些实施例中，折射率吻合材料相对于组成物的重量/体积百分比浓度为30～80％(w/v)。
[0024]在某些实施例中，渗透剂相对于组成物之体积/体积百分比浓度为0.1～2％(v/v)。
[0025]在某些实施例中，第一染色物质相对于组成物的浓度为100ng/ml～1mg/ml。
[0026]在某些实施例中，第二染色物质相对于组成物的浓度为1μg/ml～1mg/ml。
[0027]在某些实施例中，澄清组成物或套组还包含第三染色物质。
[0028]本专利技术还公开了一种用于使生物材料透明化并进一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于包含：折射率吻合材料；渗透剂，其包含：表面活性剂；第一染色物质；第二染色物质；以及溶剂。2.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述组成物的pH值为6.5至8.4。3.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述折射率吻合材料包含：放射性对比剂、单醣、寡醣或上述任意的组合。4.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述折射率吻合材料包含：碘克沙醇、果糖、蔗糖或上述任意的组合。5.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述渗透剂包含：清洁剂。6.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述表面活性剂不包含任何离子物质。7.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述接口活性剂包含：聚乙二醇辛基苯基醚、吐温
‑
20、吐温
‑
80、十二烷基硫酸钠、十二烷基
‑
β
‑
D
‑
麦芽糖苷、尿素、CHAPS、脱氧胆酸钠或上述任意的组合。8.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述接口活性剂选自由聚乙二醇辛基苯基醚和吐温
‑
20所组成的群组。9.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述接口活性剂的临界微胞浓度为0.01至0.025。10.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述溶剂包含：磷酸盐缓冲生理盐水、双蒸水或上述的组合。11.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述第一染色物质和所述第二染色物质是选自由促进剂、拮抗剂、抗体、蛋白质卵白素、右旋糖酐、脂质核苷酸或蕈类毒素所组成的群组。12.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述第一染色物质包含：4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚、碘化丙啶、SYTO 16、SYTO 40、NucRed或NucGreen。13.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述第二染色物质包含：亲脂性示踪剂荧光染料。14.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述折射率吻合材料相对于所述组成物的重量/体积百分比浓度为30～80％(w/v)。15.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述渗透剂相对于所述组成物的体积/体积百分比浓度为0.1～2％(v/v)。16.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在
于：其中所述第一染色物质相对于所述组成物之浓度为100ng/ml～1mg/ml。17.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中所述第二染色物质相对于所述组成物的浓度为1μg/ml～1mg/ml。18.根据权利要求1所述的用于使生物材料透明并进一步染色的澄清组成物，其特征在于：其中多元醇、有机溶剂或上述任意组合相对于所述溶剂的体积/体...

【专利技术属性】
技术研发人员：李佳容，林宇捷，林彦颖，
申请(专利权)人：捷络生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：