在多相生物材料上负载微生物的方法技术

本发明专利技术涉及用于将微生物或其部分负载在预合成的包含纳米纤维素的多相生物材料上和/或其中的方法，其中所述微生物被重悬在缓冲液或培养基中并负载在所述多相生物材料中和/或其上，以及此类经负载的多相生物材料在营养、食品、药品、医疗、化妆品，尤其是在口腔、粘膜、皮肤和透皮、眼、皮肤病学或女性健康应用中的用途。用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在多相生物材料上负载微生物的方法


[0001]本专利技术涉及用于将微生物或其部分负载在预合成的包含纳米纤维素的多相生物材料上和/或其中的方法，其中所述微生物被重悬在缓冲液或培养基中并负载在所述多相生物材料中和/或之上，以及此类负载的多相生物材料在药品、医疗、化妆品、尤其是口腔、粘膜、皮肤和透皮、眼、皮肤病学或女性健康应用中的用途。

技术介绍

[0002]益生菌是当以充足的量施用时对宿主赋予健康益处的活微生物(FAO
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WHO；Probiotics in food.Health and nutritional properties and guidelines for evaluation；FAO Food and Nutritional Paper 85，2006)。被最广泛研究且可商购的益生菌主要是来自乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)物种的微生物。另外，还使用一些其他的微生物，诸如丙酸杆菌属(Propionibacterium)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和酵母。含有益生菌/合生元的制剂，诸如补充剂/化妆品/生物药品/护理产品是“被设计在基本营养功能以外具有生理益处和/或减少慢性疾病的风险”的系统。
[0003]化妆品/局部用产品通常含有防腐剂以防止不需要的细菌生长并提高产品的稳定性。因此，含有需要的活微生物(例如，益生菌/合生元)的化妆品/局部用产品面临关于稳定性的挑战。因此，许多声称是“益生菌”的化妆品/局部用产品不包含按照Mechtnikoff关于“益生菌”的定义(即，“当以足够量施用时对宿主赋予健康益处的活微生物”)所述的活细菌，而是包含死微生物或其部分或代谢物。
[0004]所谓的益生元定义为选择性发酵的成分，其导致胃肠道微生物群的组成和/或活性发生特定变化，从而为宿主健康带来益处。益生元通常在胃肠道运输过程中充当截留基质(entrapping matrices)，在肠道中进一步释放微生物并随后作为发酵底物(Koh等人，Food Microbiol.2013Oct；36(1):7
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13)。大多数益生元是来自植物来源的复杂碳水化合物。益生元和益生菌可以组合起来以支持后者的存活和代谢活性，并且所得产品属于合生元类别。合生元是指以协同形式(因此是合生元)组合益生菌和益生元的食品成分或膳食补充剂(Pandey等人，J Food Sci Technol.2015Dec；52(12):7577
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87)。根据本专利技术，术语合生元还包括益生菌与成分(“益生元”)的协同组合，通过添加的微生物选择性代谢所述成分形成具有健康益处的代谢物。
[0005]就此而言，益生菌作为有价值的成分出现用于推荐能够支持健康和福利的膳食补充剂、功能性食品和局部应用。这些是活微生物(在大多数情况下)，它们被认为通过更新天然微生物群、通过竞争减少病原体或在不同的位置(肠道、皮肤、口腔、阴道)产生活性代谢物展现调控特性，从而对宿主提供有益的健康效应。然而，益生菌当应用时经常被各种条件(例如，强酸性的胃，胆汁酸或局部环境因素等)灭活，并且因此，益生菌的有效性很大程度上取决于能够到达作用位置的活细胞数。因此，用于化妆品、生物药品或食品应用的巧妙递
送系统(所述系统能够截留、保护、运输和适宜地递送活性剂)的开发，从食品应用，而且尤其是局部应用的根本角度来看是很重要的。
[0006]益生菌/合生元在哺乳动物/人受试者的许多位置，例如，胃肠道、皮肤、粘膜等处的促进健康的有益效应是为人所熟知的。一个问题是将有益的益生菌/合生元以所需的量、活性的方式提供至它们的作用部位并持续以展现效应所需的时间。后一个方面对于在皮肤和粘膜(诸如内阴和外阴粘膜或口腔粘膜)上的局部应用尤其重要。在许多情况下，对于发挥全部有益的和靶向作用而且在储存持续时间内存活直至使用，益生菌/合生元需要额外的辅因子和营养物或起始材料和环境要求(如湿度等)。而且，关于所述应用，与指定的成分/原料的组合可以具有共生效应。这对用于局部应用的益生菌/合生元制剂提出了额外的挑战。用于局部应用的霜剂制剂经常仅产生瞬时利用性和有限的生物活性物质活力。
[0007]因此，要解决的问题是提供简单且快速的用于益生菌微生物的负载技术并且提供制得的产品，所述产品能够：
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保护(经常是敏感性的)益生菌/生物活性物质，
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在正确的部位(例如，局部、胃肠道、阴道)达到足够高数量的有益效应，
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截留/负载生物活性物质，使得它们在作用部位处达到对细胞或活性物质/代谢物的缓释(延长作用)，
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当与另外的成分组合时，允许益生菌原位产生活性成分，由此产生合生元，
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在整个储存期间保持益生菌/合生元有活力直到应用的时间，
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吸收环境流体(例如，卫生棉条，口腔应用)，
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提供对潜在的不良气味的掩蔽，
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被最终消费者简单应用，和
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使用后是可生物降解的。
[0017]用于生物医药应用的递送系统必须解决截留的生物物质方面以及这些与用户相关的方面的问题。至多递送系统本身具有支持效应，诸如细菌纳米纤维素，其毒性低，水/流体吸收容量高。本专利技术提供了一种方法作为解决方案，该方法产生了细菌/微生物(纳米)纤维素制剂，该制剂保护益生菌和/或另外的生物活性成分用于局部应用。
[0018]纳米纤维素是指纳米结构的纤维素的术语。这可以是纤维素纳米晶体(CNC或NCC)，也称作微纤化纤维素(MFC)的纤维素纳米纤维(CNF)，或细菌纳米纤维素(BNC)，BNC是指由细菌产生的纳米结构的纤维素。BNC是由诸如木糖驹形氏杆菌(Komagataeibacter xylinus)的菌株产生的纳米纤丝聚合物，木糖驹形氏杆菌是在纤维素制备中提供最高效率的最佳细菌物种之一。BNC是具有诸如下列的独特特性的生物材料：化学成分纯、优异的机械强度、高柔韧性、高吸收性、因卓越的可成形性和柔软度形成任意形状和尺寸的可能性，等等。此外，所述材料是素食的和严格素食的，且包含高水分含量。
[0019]BNC的制备因其环境友好特性而越来越广泛。已经开发了许多类型的BNC用于各种应用，包括组织再生、药物递送系统、血管移植物、以及用于体外和体内组织工程的支架(Czaja等人，Biomacromolecules 2007 Jan；8(1):1
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12；de Azeredo，Trends Food Sci Technol 2013 30:56
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69；Almeida等人，Eur J Pharm Biopharm 2014 86:332本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于将微生物或其部分负载在预合成的细菌合成的纳米纤维素(BNC)非织造生物材料上和/或其中的方法，其中所述方法包括以下步骤：
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合成BNC非织造生物材料，
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将所述BNC非织造生物材料用渗透和/或吸湿有效的溶液温育，以及
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将所述微生物负载在BNC材料中和/或之上，
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将负载的BNC非织造生物材料冷冻干燥至少24小时，至残留水分含量为20％或更低。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过以下任一步骤将所述微生物负载在BNC材料中和/或之上：a)将多相生物材料与所述微生物以300rpm或更高、优选500rpm至3500rpm在37℃或更低、优选10℃至37℃的温度混合1
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60分钟，优选5
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10分钟，或b)将所述微生物注入到多相生物材料中并在37℃或更低、优选4℃至37℃的温度孵育多至72小时，优选多至1小时，或c)将处于缓冲液或培养基中的多相生物材料与重悬的微生物在37℃或更低的温度孵育60分钟或更短时间，优选10分钟或更短时间，或d)在37℃或更低的温度喷涂所述微生物60分钟或更短时间，优选10分钟或更短时间。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤中的一个或多个：
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在用所述微生物负载之前，将所述BNC非织造生物材料灭菌，
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在负载之前，将所述微生物重悬在缓冲液或培养基中，
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将负载的BNC非织造生物材料放置在两片箔之间用于冷冻干燥，优选地所述箔包含聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、铝(Al)和聚乙烯(PE)中的一种或多种，
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将经冷冻干燥的负载的BNC非织造生物材料包装在复合箔中，优选地所述复合箔包含聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、铝(Al)和聚乙烯(PE)中的一种或多种，并且密封所述复合箔。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物作为营养细胞或以休眠形式、优选作为细菌孢子、或作为细胞提取物负载。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物是湿的或干的和/或经预培养的或未经预培养的。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多相生物材料是湿的或干燥的或部分干燥的或在缓冲液中重新溶胀的。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纳米纤维素衍生自植物、藻类或微生物，优选衍生自驹形氏杆菌属(Komagataeibacter),更优选衍生自木糖驹形氏杆菌(Komagataeibacter xylinus)。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述BNC非织造生物材料具有至少0.5mm、优选1mm至5mm、更优选2mm至3mm的平均厚度。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述渗透和/或吸湿有效的溶液含有单糖、盐、含糖或糖样物质、聚氧乙烯、这些水分结合物质组的不同代表成员的组合和/或这些水分结合物质组的一种和/或多种代表成员与一种或多种表面活性剂和/或一种或多种防腐剂的组合。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物是选自下列的益生细菌株或益生酵母株：双歧杆菌属(Bifidobacterium)，肉食杆菌属(Carnobacterium)，棒状杆
菌属(Corynebacterium)，Cutibacterium，乳杆菌属(Lactobacillus)，乳球菌属(Lactococcus)，明串珠菌属(Leuconostoc)，微杆菌属(Microbacterium)，酒球菌属(Oenococcus)，巴斯德芽菌属(Pasteuria)，片球菌属(Pediococcus)，丙酸杆菌属(Propionibacterium)，链球菌属(Streptococcus)，芽孢杆菌属(Bacillus)，地芽孢杆菌属(Geobacillus)，葡糖杆菌属(Gluconobacter)，黄单胞菌属(Xanthonomas)，念珠菌属(Candida)，德巴利酵母属(Debaryomyces)，有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，驹形氏酵母属(Komagataella)，林德纳氏酵母(Lindnera)，Ogataea，酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)，法夫酵母(Xanthophyllomyces)和耶氏酵母(Yarrowia)，微球菌属(Micrococcus)，优选Cutibacterium acnes，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；德氏乳杆菌(Lactobacillus delbr
ü
ckii)，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，副干酪乳杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：赢创运营有限公司，
类型：发明
国别省市：