一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法技术

提供了一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法，将模拟干细胞巢的明胶、氨基多糖等组分与三偏磷酸钠混合后制成胶液，再将纳米碳酸钙充分分散在胶液中，胶液在分散剂中形成微球后转入到碳酸钠或碳酸钾溶液中进行交联定型，再转移到稀酸溶液中溶解纳米碳酸钙，微球脱除纳米碳酸钙后在微球内部形成大量孔道，可用于干细胞3D培养。三偏磷酸钠交联剂通过磷酸酯键完成明胶及氨基多糖中羟基的交联，可以用胶原蛋白酶和磷酸酯酶温和地裂解多孔载体并释放其中培养的干细胞。孔载体并释放其中培养的干细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及干细胞培养领域，尤其是涉及一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法。

技术介绍

[0002]干细胞种类很多，已经在疾病治疗、医美、抗衰、药物筛选等众多领域大量应用。干细胞培养已经成为整个干细胞产业链发展的制约瓶颈，干细胞培养器已经成为干细胞培养领域的开发热点。按干细胞培养装置的特点，分为2D培养与3D培养两大类。2D培养主要通过增大培养皿进行，批量换液、扩散法供气。3D培养主要在立体容器中完成，可以自主调控培养液的组成，可以主动向培养液供气，对培养过程的调控手段更丰富，3D培养技术逐渐成为干细胞产业链的主流。
[0003]干细胞3D培养载体是影响干细胞3D培养产业链的关键要素，有众多厂家进行干细胞3D培养载体研究开发，但多数厂家在制造干细胞3D培养载体尤其是多孔微载体时都是采用有机溶剂，包括苯，作为致孔剂，对培养的干细胞有潜在的危害，迫切需要探索对干细胞友好的致孔剂。
[0004]同时，传统的干细胞培养都采用胰酶消化干细胞，从而使干细胞从不溶的载体上解离下来；这类干细胞分离方法对干细胞的损伤极大，干细胞产业急需可以温和裂解的干细胞培养载体，在载体裂解过程中最大限度地减少对干细胞的损伤。能够在不伤害干细胞条件下裂解的、多孔的、仿真干细胞生巢设计的、对干细胞友好的新型干细胞3D培养载体已经成为干细胞产业发展的瓶颈。

技术实现思路

[0005]针对上述不足，本专利技术提供一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法，其实质以对干细胞友好的碳酸钙材料为致孔剂，利用稀酸将碳酸钙溶解除去并形成载体内部孔道，整个干细胞3D培养用载体制造过程中不使用有机溶剂，有效避免利用挥发法去除致孔用有机溶剂造成的干细胞3D培养载体内有机溶剂残留问题。同时，根据干细胞巢组成中胶原蛋白、氨基聚糖等都具有多羟基的结构特点，开发了以三偏磷酸钠在碱性条件下通过大量的磷酸酯键交联干细胞巢仿真组分的方法，制备的干细胞3D培养用多孔微载体能够用胶原蛋白酶和磷酸酯酶温和裂解，有效避免多孔载体裂解并释放干细胞时对干细胞的损伤。
[0006]本专利技术克服现有干细胞培养载体的不足，专利技术的仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法的具体步骤如下：S1 将模拟干细胞巢的明胶、氨基多糖等组分与三偏磷酸钠混合后制备胶液，在搅拌条件下将纳米碳酸钙按比例分散到胶液中；S2 将含纳米碳酸钙的胶液在分散剂中形成微球；S3将微球转到碳酸钠或碳酸钾溶液中交联定型；
S4 将完成交联定型的微球转移到稀酸溶液中，利用稀酸脱除纳米碳酸钙并在微球中形成大量孔道；S5将多孔微球充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存。
[0007]优选地，使用三偏磷酸钠为交联剂，通过磷酸酯键完成羟基交联，形成三维网状结构用于干细胞3D培养，且能够用胶原蛋白酶和磷酸酯酶温和裂解。
[0008]优选地，S1使用纳米碳酸钙为致孔剂，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例范围1：0.1-2。
[0009]优选地，S2中可以滴注法制作胶液微球，控制胶液微球的大小0.1-1mm，其制作中使用的分散剂可以选用液体石蜡，也可以用其他与水不混溶的分散剂。也可以使用离心分散法、高速搅拌法制作胶液微球。
[0010]优选地，将微球置于碱性溶液中交联定型，优选使用碳酸钠或碳酸钾溶液。
[0011]优选地，利用稀酸脱除载体微球内包裹的纳米碳酸钙，形成多孔微球载体。
[0012]优选地，优先采用辐照灭菌的方法进行多孔微球载体的无菌处理。
[0013]优选地，干仿真干细胞巢的3D培养用微载体可以用于MSC类干细胞3D培养制备，也适用HSC类干细胞3D培养制备。
[0014]有益效果：本专利技术提供一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法，其实质以对干细胞友好的碳酸钙材料为致孔剂，利用稀酸就可以把碳酸钙溶解除去，整个干细胞3D培养用载体制造过程中不使用有机溶剂，有效避免利用挥发法去除致孔用有机溶剂造成的干细胞3D培养载体内有机溶剂残留问题。
[0015]同时，载体制备中使用三偏磷酸钠在碱性条件下通过磷酸酯键进行胶原蛋白、氨基聚糖中羟基基团的交联，可以在完成干细胞3D培养后利用胶原蛋白酶和磷酸酯酶完成多孔载体的温和裂解，有效减少裂解载体释放干细胞时对干细胞的损伤。下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术中涉及到研发团队已经申报专利的相关技术、方法与设备，在实施例中仅重点说明相关专利技术或方法或设备在干细胞3D培养制备过程中的主要用途，不再具体描述已申报专利的具体细节。
[0016]实施例1（1）进行干细胞3D培养用胶原微球载体的制备S1 将模拟干细胞巢的胶原蛋白、氨基多糖等组分与三偏磷酸钠混合后制备胶液，具体比例为（明胶：硫酸软骨素：透明质酸：三偏磷酸钠=9：1：1：5），在搅拌条件下将纳米碳酸钙按比例分散到胶液中，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例为1：0.5；S2 将含纳米碳酸钙的胶液通过更换不出孔径的针头滴加到分散剂中形成直径为0.5mm微球；S3将微球转到1mol/L碳酸钠或碳酸钾溶液中交联定型；S4 将完成交联与固定的微球转移到pH6.0稀盐酸溶液中，补加保持体系的酸碱度稳定于pH6.0，充分脱除纳米碳酸钙并在微球中形成大量孔道；S5将多孔微载体充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存。
[0017]（2）以干细胞3D培养用多孔微载体进行MSC干细胞3D培养S6利用干细胞3D培养仪进行干细胞3D培养增殖；干细胞3D培养仪涉及的已经申报专利
为：201910408085.X 一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.X 一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8 一种3D干细胞仿真培养设备。具体的MSC干细胞3D培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3D仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3D仿真培养用增殖培养基的制作方法）。
[0018]S7将以干细胞3D培养用多孔微载体与MSC干细胞种子混合，按每百万个MSC用100mg多孔微载体的比例进行接种，接种后进行MSC干细胞3D培养增殖。
[0019]S8 利用胶原蛋白酶和磷酸酯酶裂解多孔微载体并释放MSC细胞，对获得的MSC干细胞进行相应的检测并保存。获得MSC细胞按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：CD29(99.67%)、CD 44(99.56%)、CD73 (99.76%)、CD90 (99.86%)、CD 105(99.76%); CD14 (0.15%)、CD19 (0.09%)、CD31 (0.17%)、CD34 (0.18%)、CD45 (0.07%)、HLA-DR (0%)； MSC干细胞的功能指标超过国内与国际MSC表面抗原的要求。
[0020]实施例2（1）进行干细胞3D培养用胶原微球载体的制备S1 将模拟干细胞巢的胶原蛋白、氨基多糖等组分与三偏磷酸钠混本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法，其特征在于，具体步骤如下：S1 将模拟干细胞巢组成的明胶、氨基多糖等组分与三偏磷酸钠混合后制备胶液，在搅拌条件下将纳米碳酸钙按比例分散到胶液中；S2 将含纳米碳酸钙的胶液在分散剂中形成微球；S3将微球转到碳酸钠或碳酸钾溶液中完成交联定型；S4 将完成交联定型的微球转移到稀酸溶液中，利用稀酸脱除微球内包裹的纳米碳酸钙并在微球中形成大量孔道；S5将多孔微球充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存。2.根据权利要求1所述的一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法，其特征在于，使用对细胞友好的三偏磷酸钠为交联剂，通过羟基交联使仿真人体干细胞巢的多种组份形成三维网状结构。3.根据权利要求1所述的一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法，其特征在于，S1中使用纳米碳酸钙为致孔剂，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例范围1：0.1-2。4.根据权利要求1所述的一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法，其特征在于，S2中控制分散...

【专利技术属性】
技术研发人员：华子昂，朱美瑛，刘宝全，万君兴，竹添，张建，赵凯龙，
申请(专利权)人：华子昂，
类型：发明
国别省市：