一种干细胞3D培养用明胶微球载体及其制备方法技术

提供了一种干细胞3D培养用明胶微球载体及其制备方法，包括将纳米碳酸钙充分分散在明胶胶液中，将胶液在分散剂中制成微球，用高浓度戊二醛进行快速定型后，转入到含戊二醛的稀酸溶液中，利用稀酸溶解纳米碳酸钙的方法在微球中形成大量孔道，戊二醛进入孔道完成微球内部明胶的固定，最终获得完全固定的多孔明胶微球载体用于干细胞3D培养。球载体用于干细胞3D培养。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞3D培养用明胶微球载体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及干细胞培养领域，尤其是涉及一种干细胞3D培养用明胶微球载体及其制备方法 。
技术介绍
干细胞种类很多，已经在疾病治疗、医美、抗衰、药物筛选等众多领域大量应用。干细胞培养已经成为整个干细胞产业链发展的制约瓶颈，干细胞培养器已经成为干细胞培养领域的开发热点。按干细胞培养装置的特点，分为2D培养与3D培养两大类。2D培养主要通过增大皿进行，批量换液、扩散法供气。3D培养主要在立体容器中完成，可以自主调控培养液的组成，可以主动向培养液供气，对培养过程的调控手段更丰富，3D培养技术逐渐成为干细胞产业链的主流。
[0002]干细胞3D培养载体是影响干细胞3D培养产业链的关键要素，有众多厂家进行干细胞3D培养载体研究开发，但多数厂家在制造干细胞3D培养载体尤其是多孔微载体时都是采用有机溶剂，包括苯，作为致孔剂，对培养的干细胞有潜在的危害，迫切需要探索对干细胞友好的致孔剂。
[0003]同时，传统的干细胞培养都采用胰酶消化干细胞，从而使干细胞从不溶的载体上解离下来；这类干细胞分离方法对干细胞的损伤极大，干细胞产业急需可以温和裂解的干细胞培养载体，在载体裂解过程中最大限度地减少对干细胞的损伤。能够在不伤害干细胞条件下裂解的、多孔的、仿真干细胞生巢设计的、对干细胞友好的新型干细胞3D培养载体已经干细胞产业发展瓶颈。

技术实现思路

[0004]针对上述不足，本专利技术提供一种仿真干细胞巢的3D培养用微载体及其制备方法，其实质以对干细胞友好的碳酸钙材料为致孔剂，利用稀酸将碳酸钙溶解除去并形成载体内部孔道，整个干细胞3D培养用载体制造过程中不使用有机溶剂，有效避免利用挥发法去除致孔用有机溶剂造成的干细胞3D培养载体内有机溶剂残留问题。同时，以交联明胶制备的干细胞3D培养用多孔微载体能够用胶原蛋白酶温和裂解，有效避免多孔载体裂解并释放干细胞时对干细胞的损伤。
[0005]本专利技术的干细胞3D培养用明胶载体及其制备方法的具体要求步骤如下：S1 在搅拌条件下将纳米碳酸钙按比例分散到明胶胶液中；S2 含纳米碳酸钙的明胶胶液在分散剂中形成微球；S3将微球置于高浓度戊二醛溶液中快速定型，再转入含有戊二醛的稀酸溶液中，利用戊二醛进行明胶固定保留微球形态，利用稀酸使碳酸钙溶解形成孔道；S4 将完成明胶固定与碳酸钙溶解的微球充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存。
[0006]优选地，S1使用纳米碳酸钙为致孔剂，将纳米碳酸钙充分分散到明胶胶液中。
[0007]优选地，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例范围1：0.1-2。
[0008]优选地，S2中可以滴注法制作胶液微球，通过不同孔径的针头控制胶液微球的大
(99.6%)、CD 105(99.64%); CD14 (0.16%)、CD19 (0.06%)、CD31 (0.28%)、CD34 (0.13%)、CD45 (0.07%)、HLA-DR (0%)； MSC干细胞的功能指标超过国内与国际MSC表面抗原的要求。
[0020]实施例2（1）进行干细胞3D培养用明胶微球载体的制备S1 在搅拌条件下将纳米碳酸钙按比例分散到明胶胶液中，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例为1：2；S2 用滴注法制作胶液微球，通过更换不同孔径的针头控制胶液微球的大小1mm；S3将微球置于高浓度戊二醛溶液中快速定型，再转入含有戊二醛的稀酸溶液中，利用戊二醛进行明胶固定保留微球形态，利用稀酸使碳酸钙溶解形成孔道； 戊二醛的稀酸溶液中戊二醛的浓度范围0.1%，稀酸的酸碱度范围pH 4.5。
[0021]S4 将完成明胶固定与碳酸钙溶解的微球充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存。
[0022]（2）以干细胞3D培养用明胶载体进行MSC干细胞3D培。
[0023]S5利用干细胞3D培养仪进行干细胞3D培养增殖；干细胞3D培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.X一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.X一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3D干细胞仿真培养设备。具体的MSC干细胞3D培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3D仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3D仿真培养用增殖培养基的制作方法）：S6将以干细胞3D培养用明胶载体与MSC干细胞种子混合，按每百万个MSC用100mg微载体的比例进行接种，接种后进行MSC干细胞3D培养增殖。
[0024]S7 对获得的MSC干细胞进行相应的检测并保存。获得MSC按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：CD29(98.97%)、CD 44(99.98%)、CD73 (99.95%)、CD90 (99.99%)、CD 105(99.67%); CD14 (0.19%)、CD19 (0.09%)、CD31 (0.25%)、CD34 (0.19%)、CD45 (0.07%)、HLA-DR (0%)； MSC干细胞的功能指标超过国内与国际MSC表面抗原的要求。
[0025]实施例3（1）进行干细胞3D培养用明胶微球载体的制备S1 在搅拌条件下将纳米碳酸钙按比例分散到明胶胶液中，明胶与纳米碳酸钙的质量混合比例为1：0.1；S2 用离心分散法在分散剂中制作胶液微球，控制胶液微球的大小0.1-0.2mm；S3将微球置于高浓度戊二醛溶液中快速定型，再转入含有戊二醛的稀酸溶液中，利用戊二醛进行明胶固定保留微球形态，利用稀酸使碳酸钙溶解形成孔道； 戊二醛的稀酸溶液中戊二醛的浓度范围5%，稀酸的酸碱度范围pH 6.5。
[0026]S4 将完成明胶固定与碳酸钙溶解的微球充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存。
[0027]（2）以干细胞3D培养用明胶载体进行MSC干细胞3D培养S5利用干细胞3D培养仪进行干细胞3D培养增殖；干细胞3D培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.X一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.X一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3D干细胞仿真培养设备。具体的MSC干细胞3D培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3D仿真培养用增殖培养
基；202010763837.7一种干细胞3D仿真培养用增殖培养基的制作方法）：S6将以干细胞3D培养用明胶载体与MSC干细胞种子混合，按每百万个MSC用100mg微载体的比例进行接种，接种后进行MSC干细胞3D培养增殖。
[0028]S7 对获得的MSC干细胞进行相应的检测并保存。获得MSC按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：CD29(98.97%)、CD 44(99.38%)、CD73 (99.35%)、CD90 (99.43%)、CD 105(99.54%); CD14 (0.26%)、CD19 (0.16%)、CD31 (0.18%)、CD34本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干细胞3D培养用明胶微球载体及其制备方法，其特征在于，具体步骤如下：S1 在搅拌条件下将纳米碳酸钙按比例分散到明胶胶液中；S2 含纳米碳酸钙的明胶胶液在分散剂中形成微球；S3将微球置于高浓度戊二醛溶液中快速定型，再转入含有戊二醛的稀酸溶液中，利用戊二醛进行明胶交联固定保留微球形态，利用稀酸使纳米碳酸钙溶解形成微球内部孔道；S4 将完成明胶交联固定与碳酸钙溶解的微球充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存。2.根据权利要求1所述的一种干细胞3D培养用明胶微球载体及其制备方法，其特征在于，S1使用纳米碳酸钙为致孔剂。3.根据权利要求2所述的明胶（或明胶）与纳米碳酸钙的质量混合比例范围1：0.1-2。4.根据权利要求1所述的一种干细胞3D培养用明胶微球载体及其制备方法，其特征在于，S2中可以滴注法、离心分散法、高速搅拌法制作胶液微球，控制胶液微球的直径大小0.1-1m...

【专利技术属性】
技术研发人员：华子昂，刘宝全，朱美瑛，万君兴，竹添，张建，赵凯龙，
申请(专利权)人：华子昂，
类型：发明
国别省市：