多重PCR芯片及利用其的多重PCR方法技术

本发明专利技术涉及一种能够同时检测多个靶基因的多重PCR芯片及利用其的PCR方法，更详细地，提供如下多重PCR芯片及利用其的多重PCR方法，即，在一个或多个反应室的内部形成在空间上分离的多个粒子形成槽，并将溶液状态的探针注入所述粒子形成槽后，施加物理刺激以形成探针粒子，且使所述粒子形成槽的平面形状不同或使形成于所述粒子形成槽的内侧面的粒子固定体的形态和图案不同，并且，通过将包括与彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的引物的探针注入所述粒子形成槽，能够基于所述探针粒子的位置和形态以及形成于所述探针粒子的内部的所述粒子固定体的形态和图案来检测多个靶基因，从而能够进行同时多重检测。从而能够进行同时多重检测。从而能够进行同时多重检测。

【技术实现步骤摘要】
多重PCR芯片及利用其的多重PCR方法


[0001]本专利技术涉及一种能够同时检测多个靶基因的多重PCR芯片及利用其的多重PCR方法。

技术介绍

[0002]聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction；PCR)是一种通过反复加热和冷却包括核酸分子的样品溶液以链状地复制并几何级数地扩增具有特定核苷酸序列的部位(靶核酸)的技术，是一项能够通过扩增、复制微量的核酸来检测靶基因的技术。
[0003]这样的PCR方法反复执行DNA变性步骤、退火步骤以及DNA合成步骤，DNA变性步骤(denaturing step)是将含有双链模板DNA的样品溶液在特定温度下，例如在约95℃下加热5秒以将双链DNA分离成单链DNA的步骤；退火步骤(annealing step)是在DNA变性步骤之后将与要扩增的规定核苷酸序列具有相辅的序列的引物注入样品溶液，并将其与单链DNA一起在特定温度下，例如在50℃下维持5秒以使引物与单链DNA的规定核苷酸序列杂交以形成部分DNA
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引物复合体的步骤；DNA合成步骤(extension step)是在退火步骤之后将将样品溶液在DNA聚合酶的活性温度下，例如在72℃下维持5秒以通过DNA聚合酶polymerase)基于部分DNA
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引物复合体的引物来形成双链DNA的步骤。另外，可以通过检测由与靶核酸结合的荧光染料生成的荧光来检测靶核酸。
[0004]为了适当地执行这样的PCR方法，除了试药(引物和荧光染料)和试料(样品溶液)外，还需要具备一个或多个反应室的PCR芯片、以及加热和冷却所述PCR芯片以诱导扩增反应并测量其结果的PCR装置。尤其，在便携式实时PCR装置中，会使用较小而扁平的形态的微型PCR芯片。微型PCR芯片具备一个或多个能够在透明基板中容纳试药和试料的反应室。另外，在所述PCR装置中具备用于拍摄由与靶核酸结合的荧光染料产生的荧光的摄像头。
[0005]另一方面，通过一次实验检测多个靶基因被称为同时多重检测，即多重(multiplex)PCR。为了这样的多重PCR，需要使用多种多样的荧光染料，需要能够区分由多个引物构成的引物组和多种荧光染料并防止荧光染料之间的干涉的复杂的探针的设计。这是因为对应于种种荧光色的激发和发射波长带重叠。
[0006]为了解决这样的化学多重方式问题，近来在开发一种在空间上孤立化的系统。即，如专利文献中所公开，以往的多重PCR芯片将多个探针固着于一个反应室内，并诱导固定在所述反应室的探针粒子与试料之间的反应，以便能够一次扩增并检测多个靶核酸。
[0007]即，使彼此不同的种类的探针固着于反应室上的彼此不同位置以使探针在空间上分离，并将与彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的引物注入在空间上分离的探针，从而能够通过基于探针的位置分析由探针发出的荧光色来同时多重检测。这不但可以减小光学装备的大小，降低转装备价格，而且还可以提高效率，如可以缩短检测所需的时间等。
[0008]然而，以往的多重PCR芯片中存在的问题是，当使在空间上分离的探针固着于反应室上时，即，当滴下几滴包括引物的液体状态的探针使其固着时，探针滴扩散而难以形成像样的探针粒子。此外，还存在当形成探针粒子时探针粒子容易掉落的问题。此外，还存在因
仅凭探针的位置获得多样的组合存在局限性而限制可检测的靶基因的数量的问题，并且还存在由于当PCR芯片的左右发生变化使会致使探针的位置发生变化，因而难以局限同时多重检测的问题。
[0009]现有技术文献
[0010]专利文献
[0011]韩国授权专利第10
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1724281号授权(授权日：2017年04月03日)。

技术实现思路

[0012]技术问题
[0013]本专利技术旨在解决这样的问题，本专利技术的首要目的在于，提供一种能够一次同时扩增并检测多个靶核酸的多重PCR芯片。
[0014]本专利技术的另一目的在于，提供一种能够使与彼此不同的核酸分子特异性杂交的多个探针粒子在空间上孤立，并基于这些探针粒子的位置来进行同时多重检测的多重PCR芯片。
[0015]本专利技术的又一目的在于，提供一种在PCR芯片的反应室的内部形成在空间上分离的探针粒子，且在反应室的内部形成容纳预定量的探针的粒子形成槽，以便能够容易制作所述探针粒子的大小和形态的PCR芯片。
[0016]此外，本专利技术的又一目的在于，提供一种通过在用于形成探针粒子的粒子形成槽的底部和内侧面形成由凸出预定长度的多个突起构成的粒子固定体，以防止固定于所述粒子形成槽的探针粒子容易分离的方式进行固定的PCR芯片。
[0017]此外，本专利技术的又一目的在于，提供一种通过在使与核酸分子特异性杂交的多个探针粒子在空间上孤立的同时，使探针粒子的大小、形态或图案不同或使粒子固定体的形态或图案彼此不同，能够基于探针粒子的位置以及其形态和图案对多种多样的靶核酸进行同时多重检测的多重PCR芯片。
[0018]此外，本专利技术的另一目的在于，提供一种用一个连接通道连接多个反应室，并在固定于所述多个反应室的探针粒子的表面涂布防水涂层剂，以便在将试料注入PCR芯片时能够通过一次的试料的注入将试料填充到所有反应室，从而使同时多重检测容易的多重PCR芯片。
[0019]同时，本专利技术提供一种利用上述多重PCR芯片的多重PCR方法。
[0020]技术方案
[0021]作为用于达成本专利技术的目的的方案，本专利技术的多重PCR芯片包括：基板，其由透明的材料制成；一个或多个反应室，其以预定的大小和深度形成于所述基板上；以及多个粒子形成槽，其以能够容纳预定量的液体状态的探针的大小和深度形成于所述反应室的内部，并且注入在空间上分离的彼此不同的粒子形成槽的所述探针包括与彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的彼此不同的种类的引物、与所述引物结合的荧光染料以及使所述引物固着的支撑体。
[0022]作为本专利技术的另一实施例，本专利技术的多重PCR芯片包括：基板，其由透明的材料制成；一个或多个反应室，其以预定的大小和深度形成于所述基板上；以及多个粒子形成槽，其以能够容纳预定量的液体状态的探针的大小和深度形成于所述反应室的内部，并且所述
粒子形成槽呈多种平面形状，注入于呈彼此不同的平面形状的粒子形成槽的所述探针包括与彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的彼此不同的种类的引物、与所述引物结合的荧光染料以及使所述引物固着的支撑体。
[0023]在本专利技术中，所述探针中包括的支撑体通过物理刺激(光、温度、超声波)来形成三维的网络结构体以形成对应于所述粒子形成槽的形态的探针粒子。
[0024]在所述粒子形成槽的内部形成有用于防止所述探针粒子脱离的粒子固定体。
[0025]所述粒子固定体由从所述粒子形成槽的底部或内侧面凸出预定长度地形成的多个突起构成并与所述探针粒子一体地结合。
[0026]所述粒子固定体形成为彼此不同的形态或图案，形成于在空间上分离的所述粒子形成槽的粒子固定体具有彼此本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重PCR芯片，其特征在于，包括：基板，其由透明的材料制成；一个或多个反应室，其以预定的大小和深度形成于所述基板上；以及多个粒子形成槽，其以能够容纳预定量的液体状态的探针的大小和深度形成于所述反应室的内部，并且注入在空间上分离的彼此不同的粒子形成槽的所述探针包括与彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的彼此不同的种类的引物、与所述引物结合的荧光染料以及使所述引物固着的支撑体。2.一种多重PCR芯片，其特征在于，包括：基板，其由透明的材料制成；一个或多个反应室，其以预定的大小和深度形成于所述基板上；以及多个粒子形成槽，其以能够容纳预定量的液体状态的探针的大小和深度形成于所述反应室的内部，并且所述粒子形成槽呈多种平面形状，注入于呈彼此不同的平面形状的粒子形成槽的所述探针包括与彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的彼此不同的种类的引物、与所述引物结合的荧光染料以及使所述引物固着的支撑体。3.根据权利要求1或2所述的多重PCR芯片，其特征在于，所述探针中包括的支撑体通过物理刺激(光、温度、超声波)来形成三维的网络结构体以形成对应于所述粒子形成槽的形态的探针粒子。4.根据权利要求3所述的多重PCR芯片，其特征在于，在所述粒子形成槽的内部形成有用于防止所述探针粒子脱离的粒子固定体。5.根据权利要求4所述的多重PCR芯片，其特征在于，所述粒子固定体由从所述粒子形成槽的底部或内侧面凸出预定长度地形成的多个突起构成并与所述探针粒子一体地结合。6.根据权利要求4所述的多重PCR芯片，其特征在于，所述粒子固定体形成为彼此不同的形态或图案，形成于在空间上分离的所述粒子形成槽的粒子固定体具有彼此不同的形态或图案，并且注入于所述粒子形成槽的所述探针包括与彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的彼此不同的种类的引物。7.根据权利要求1或2所述的多重PCR芯片，其特征在于，形成于所述基板上的反应室的数量为多个，所述多个的反应室通过一个连接通道串联连接，在所述连接通道的一端形成有用于注入试料的注入口，在另一端形成有排出试料的排出口，以使通过所述注入口注入的试料被供应并填充到所有反应室。8.一种多重P...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐有振，崔玉兰，李都富，朴智荣，
申请(专利权)人：基因系统有限公司，
类型：发明
国别省市：