一种衍生化-气相色谱-质谱方法分析烟草根系中烟酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种衍生化

【技术实现步骤摘要】
一种衍生化
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气相色谱
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质谱方法分析烟草根系中烟酸的方法


[0001]本专利技术涉及一种衍生化
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气相色谱
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质谱方法分析烟草根系中烟酸的方法，属于烟草根系中烟碱合成前体物烟酸的测定方法领域。

技术介绍

[0002]广义的烟酸是维生素B类中重要的一类维生素，它包含烟酸与烟酰胺二种。在生物体中，烟酸与烟酰胺能够与各种脱氢酶反应生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，此外烟酸与烟酰胺也能够与多糖或多肽结合为化学结合态烟酸。因此，烟酸与烟酰胺可以分为游离态与结合态2种。游离态的烟酸通常用稀酸性水溶液提取后进行检测分析，结合态的烟酸需要强碱性或酸性水溶液加热水解转化为游离的烟酸后进行检测分析。
[0003]游离烟酸在烟草根系中是烟碱合成的关键前体物之一，烟碱的合成前提物主要有2个，一个为甲基吡咯环，另一个为烟酸，甲基吡咯环主要由精氨酸与鸟氨酸分别通过精氨酸脱羧酶(ADC)与鸟氨酸脱羧酶(ODC)合成腐胺，再由腐胺N
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甲基转移酶形成N
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甲基腐胺，进一步由腐胺N
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甲基氧化酶氧化得到N
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甲基氨基丁醛，N
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甲基氨基丁醛进一步自发转变为合成烟碱所必须的吡咯烷环；烟酸主要是通过天冬氨酸经吡啶核苷酸循环形成，再参与烟碱的合成；也可以通过色氨酸转化为喹啉酸后，再转化为烟酸。因此，对烟草根系中烟酸进行定性与定量分析，能深入的了解烟碱的合成途径，为指导烟草氮/生物碱代谢途径分析提供一定的理论基础。
[0004]现有烟酸的测定方法包括比色法、微生物法、毛细管电泳法、高效液相色谱法。其中，微生物法和高效液相色谱法是我国国标推荐的检测婴幼儿食品及乳品中烟酸及烟酰胺的方法。比色法的原理为反应，需要使用高毒的溴化氰，灵敏度相对较低，专一性较差，所有含吡啶环的物质均显色。微生物法是测定烟酸及烟酰胺的经典方法，通过使用不同的微生物可以测定食品中游离烟酸含量或总烟酸的含量，但是该方法实验周期长重复性差。超高效液相色谱
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串联质谱法测定谷物中的总烟酸，是检测食品中烟酸及烟酰胺的另一强有力的手段，但该方法基质效应显著，易受到其它杂质的干扰，从而影响结果的准确性。

技术实现思路

[0005]基于上述，本专利技术提供一种衍生化
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气相色谱
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质谱方法分析烟草根系中烟酸的方法，以解决现有技术检测烟酸灵敏度相对较低，专一性与重复性较差、基质效应较高的技术问题。
[0006]本专利技术的技术方案是：一种衍生化
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气相色谱
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质谱方法分析烟草根系中烟酸的方法，包括以下步骤：
[0007]S1烟草根系样品提取：将内标物质与提取溶剂加入到烟草根系样品中，捣碎均质，超声提取，离心过滤得烟草根系提取溶液；
[0008]S2烟草根系提取溶液净化：依次加入甲醇与HCl活化固相萃取柱，活化后缓慢加入
提取溶液，并依次加入HCl和甲醇淋洗，再加入洗脱溶液进行洗脱，收集洗脱溶液后氮气吹干得到净化的烟酸；
[0009]S3烟酸衍生化：向净化的烟酸中加入丙酮与衍生化试剂，加入缓冲溶液后混匀，在水浴加热反应条件下进行五氟溴苄衍生化，得烟酸衍生化产物；
[0010]S4烟酸衍生化产物的分散液液微萃取：向烟酸衍生化产物中加入水与萃取溶剂，涡旋混匀并加入NaCl，再次涡旋使NaCl完全溶解，离心后取沉淀相于微量色谱瓶中进行气相色谱
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质谱分析；
[0011]S5烟酸衍生化产物的测定：采用气相色谱
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质谱
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选择性离子扫描的方式对烟酸衍生化产物进行分离与定量，以保留时间与质谱图比对进行定性，内标法定量。
[0012]可选的，在烟草根系样品提取中，内标物质为异烟酸。
[0013]可选的，在烟草根系样品提取中，提取溶剂为稀HCl溶液。
[0014]可选的，在烟草根系提取溶液净化中，固相萃取柱为PCX固相萃取柱。
[0015]可选的，在烟草根系提取溶液净化中，洗脱溶液为氨水与甲醇的混合溶液。
[0016]可选的，在烟酸衍生化中，衍生化试剂为2,3,4,5,6
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五氟溴苄。
[0017]可选的，在烟酸衍生化中，缓冲溶液为磷酸缓冲液。
[0018]可选的，在烟酸衍生化中，衍生化反应条件为50
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80℃下水浴加热反应30
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60min。
[0019]可选的，在烟酸衍生化产物的分散液液微萃取中，萃取溶剂为四氯化碳。
[0020]可选的，气相色谱
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质谱
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选择性离子扫描的条件为：色谱柱：DB
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1701；进样量：1μL；分流比：20：1；载气：氦气；流速：1.0mL/min；进样口温度：280℃；程序升温：初始温度50℃，保持3min，然后以每分钟18℃的速度升高到160℃，保持4min，再以20℃的速度升高到260℃，保持5min；离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃；电离能：70eV，传输线温度：280℃，全扫描质量数范围35
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400aum，溶剂延迟：8.20min；采集模式：全扫描与选择离子扫描同时采集。
[0021]本专利技术的有益效果是：专利技术了一种固相萃取净化
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五氟溴苄衍生化
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分散液液微萃取的前处理方法，并采用气相色谱
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质谱选择离子扫描的方法定性与定量烟草根系中的烟酸。先对样品进行固相萃取净化
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五氟溴苄衍生化
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分散液液微萃取的前处理，再采用气相色谱
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质谱选择离子扫描的方法定性与定量烟草根系中的烟酸，有效结合固相萃取、五氟溴苄衍生化与分散液液微萃取三种技术，具有分离能力强、高准确性、灵敏度及稳定性的特点，能够为烟草根系的烟碱合成与氮/生物碱代谢途径的分析提供物质基础，能克服现有技术检测烟酸灵敏度相对较低，专一性与重复性较差、基质效应较高的技术问题。
[0022]本专利技术还具有以下优点：1)PCX固相萃取柱(类似固定相)净化能有效减少杂质的干扰，提高方法的准确度；2)同分异构体内标异烟酸的使用，能提高方法的稳定性；3)2,3,4,5,6
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五氟溴苄衍生化对水不敏感，衍生化产物挥发性高，具有较好的气相色谱检测适应性；4)分散液液微萃取的高富集倍数，提高了烟酸检测的灵敏度；5)气相色谱
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质谱选择离子扫描的检测方法杂质峰干扰少，进一步提高了准确性。
附图说明
[0023]图1衍生化
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气相色谱
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质谱方法分析烟草根系中烟酸的方法流程图；
[0024]图2烟草根系样品与标样中异烟酸、烟酸的重叠色谱图(A)；异烟酸、烟酸五氟溴苄...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种衍生化
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气相色谱
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质谱方法分析烟草根系中烟酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1烟草根系样品提取：将内标物质与提取溶剂加入到烟草根系样品中，捣碎均质，超声提取，离心过滤得烟草根系提取溶液；S2烟草根系提取溶液净化：依次加入甲醇与HCl活化固相萃取柱，活化后缓慢加入提取溶液，并依次加入HCl和甲醇淋洗，再加入洗脱溶液进行洗脱，收集洗脱溶液后氮气吹干得到净化的烟酸；S3烟酸衍生化：向净化的烟酸中加入丙酮与衍生化试剂，加入缓冲溶液后混匀，在水浴加热反应条件下进行五氟溴苄衍生化，得烟酸衍生化产物；S4烟酸衍生化产物的分散液液微萃取：向烟酸衍生化产物中加入水与萃取溶剂，涡旋混匀并加入NaCl，再次涡旋使NaCl完全溶解，离心后取沉淀相于微量色谱瓶中进行气相色谱
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质谱分析；S5烟酸衍生化产物的测定：采用气相色谱
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质谱
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选择性离子扫描的方式对烟酸衍生化产物进行分离与定量，以保留时间与质谱图比对进行定性，内标法定量。2.根据权利要求1所述的衍生化
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气相色谱
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质谱方法分析烟草根系中烟酸的方法，其特征在于，在烟草根系样品提取中，内标物质为异烟酸。3.根据权利要求1所述的衍生化
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气相色谱
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质谱方法分析烟草根系中烟酸的方法，其特征在于，在烟草根系样品提取中，提取溶剂为稀HCl溶液。4.根据权利要求1所述的衍生化
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气相色谱
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质谱方法分析烟草根系中烟酸的方法，其特征在于，在烟草根系提取溶液净化中，固相萃取柱为PCX固相萃取柱。5.根据权利要求1所述的衍生化
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气相色谱
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质谱方法分析烟草根系中烟酸的方法，其特征在于，在烟草根系...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡凯，许冬青，高川川，史训瑶，张婕，赵瑞娟，雷波，高维常，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：