一种直扩ERA偶联CRISPR/cas12a的核酸一步实时检测方法技术

一种直扩ERA偶联CRISPR/cas12a的核酸一步实时检测方法，将DNA或RNA样品加入裂解液，室温下，剧烈混匀5

【技术实现步骤摘要】
一种直扩ERA偶联CRISPR/cas12a的核酸一步实时检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学检测
，具体涉及一种直扩ERA偶联CRISPR/cas12a的核酸一步实时检测方法。

技术介绍

[0002]近年来食用农产品中致病微生物的污染状况不容乐观。金黄色葡萄球菌成为仅次于沙门氏菌和副溶血杆菌的第三大微生物致病菌，导致食物中毒的事件时有发生。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，有“嗜肉菌”的别称，是革兰氏阳性菌的代表。金黄色葡萄球菌具有很强的致病性，动物被感染会后引起食源性疾病。金黄色葡萄球菌可以通过空气传播，在侵染人体后，会分泌出多种毒素，如肠毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)，SEs可以促进金黄色葡萄球菌导致人体食物中毒。肠毒素的热稳定性非常高，在煮沸的条件下(100℃)，30min还可保持生物学活性。目前已经发现的金黄色葡萄球菌肠毒素有20种，研究指出肠毒素SEI、SEG、SHE、SEE、SED、SEC、SEB以及SEA能够诱发肠炎综合征。同时金黄色葡萄球菌在接触人体如眼睛、口腔或者伤口时，攻击人体的免疫细胞，可以导致人体化脓感染，甚至可引起肺炎甚至脑膜炎和脓血症等疾病，严重的会导致死亡。因此建立一种金黄色葡萄球菌病毒的快速实时核酸检测方法是十分必要的。
[0003]大麦是我国重要的经济农作物之一，除了供人食用外，也是作为牲畜铺草或用为粗饲料的重要原料。同时大麦芽也是啤酒酿造的主要原料之一，每年的产出量和质量是至关重要的。而大麦黄花病毒(Barley yellow mosaic virus)，是大麦黄花叶病毒属的代表种，侵染大麦使其染病，导致其产量和质量严重下降，且目前尚未出现抵抗该病毒的转基因作物。因此，开展对大麦黄花叶病毒的日常病毒检测也是十分有必要的。
[0004]目前传统的分子诊断方法主要有PCR，荧光定量PCR，基因芯片和环介导等温扩增方法(LAMP)。然而，无论是PCR还是实时荧光定量PCR均需要经过预热
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变性
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退火
‑
延伸等热循环过程，才能实现核酸的扩增。且必须依赖专门的实验设备及条件，这限制了PCR技术在非实验室条件下对核酸进行快速检测的要求。
[0005]基因芯片又称生物芯片，该技术将序列一致的靶序列的探针固定在支持物表面，再与待测样本中的源核酸杂交，最终通过测定荧光强度变化，对样品的序列信息进行解读和分析，高通量获取相关生物信息然而，相对来说基因芯片比较昂贵且操作较复杂，对操作人员的专业素质要求比较高，限制了它的广泛使用。
[0006]LAMP技术是一种恒温扩增反应，比PCR反应速度更快，而且成本低，易推广。它只需一个简单的恒温器，不需要昂贵的PCR仪，缩短反应时间，且对操作人员的分子生物学技能要求不高。但是，LAMP在引物设计上要设计至少两对引物，由于引物的增多可能会导致引物与引物互相作用，从而限制了反应。另外，LAMP也可能会出现非特异性扩增。
[0007]CRISPR，全称规则成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，是细菌和某些古细菌在进化过程中形成的获得性免疫应答
系统。
[0008]当细菌受到外界噬菌体或者病毒侵染时，含有CRISPR系统的细菌能够将一些外源DNA片段整合到CRISPR短回文重复序列区域。当同样的外源核酸再次入侵时，CRISPR转录，加工获得相应成熟的crRNAs(CRISPR RNAs)引导具有核酸内切酶活性的Cas蛋白，迅速识别并切割相应的核酸(DNA或RNA)，从而达到自身的免疫保护作用。
[0009]由于CRISPR能够实现目的基因的精准切割，现如今CRISPR/cas系统已经被成功改造成强大的基因编辑工具，应用于体内的基因编辑、体外的DNA拼接，随后又用于基因转录调控研究、表观遗传修饰等方面。随着对CRISPR系统的深入挖掘，cas蛋白的反式切割活性被发现，因此，已经学者将该特性用于核酸的精准检测，甚至被誉为“下一代分子诊断工具”。
[0010]Doudna因基因编辑获得了2020年诺贝尔奖，她建立的基因编辑核酸检测方法，命名为“DETECTR”，首先用94℃10分钟热裂解制备模板，然后模板用于RPA扩增，扩增完成开盖后取出RPA产物，RPA产物作为模板加入基因编辑检测体系，终点法进行结果判定。
[0011]该方法有许多缺陷：首先，用热裂解方法制备模板容易产生气溶胶污染；采取两步反应，检测时间较长，RPA结束后开盖容易产生气溶胶污染，几次实验后即将实验室污染；RPA与基因编辑检测分两步进行，增加了劳动强度，反应结果用终点法判定，定量不精确。
[0012]目前最常用的细菌基因组DNA抽提方法是煮沸法，但是研究表明，由于金黄色葡萄球菌细胞壁较厚，单纯地煮沸并不能有效裂解细菌。同时临床分离获得的金黄色葡萄球菌多为致病菌，自身还分泌耐热核酸酶，该酶在煮沸后并不会失活，仍可以降解细菌裂解所释放出的核酸，因此煮沸法所获得的模板DNA量较少，导致出现无法检测出细菌相关基因，呈现假阴性结果。
[0013]因此，需要发展一种新的实时荧光检测方法。

技术实现思路

[0014]本专利技术的目的在于提供一种直扩ERA偶联CRISPR/cas12a的核酸一步实时检测方法，通过直扩ERA偶联CRISPR/cas12a基因编辑系统，利用cas12a蛋白的反式切割活性，进行一步法反应，降低了气溶胶污染，实现对靶标DNA或者RNA的快速精准检测，反应结果通过荧光可视化实时呈现，可定性、定量检测，减少了劳动强度，缩短检测时间。
[0015]为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0016]一种直扩ERA偶联CRISPR/cas12a的核酸一步实时检测方法，包括以下步骤：
[0017]1)设计引物
[0018]通过序列对比得到检测物目的基因的保守区，根据靶基因设计相应的引物，获得上游引物ERA
‑
F、下游引物ERA
‑
R、crRNA和ssDNA
‑
FQ；所述ssDNA
‑
FQ的具体序列为：FAM
‑5’‑
TTTTTT
‑3’‑
TAMRA；
[0019]2)制备模板
[0020]将核酸样品加入裂解液，室温下，剧烈混匀5
‑
10秒，静置1
‑
3分钟，取上清液，即可完成模板的制备；
[0021]其中，所述核酸为DNA时，裂解液中含有：终浓度为0.45
‑
0.55M的NaOH和9.5
‑
10mM的Na2EDTA；所述核酸为RNA时，裂解液中含有：终浓度为2
‑
5U/μL的RNase抑制剂、0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种直扩ERA偶联CRISPR/cas12a的核酸一步实时检测方法，包括以下步骤：1)设计引物通过序列对比得到检测物目的基因的保守区，根据靶基因设计相应的引物，获得上游引物ERA
‑
F、下游引物ERA
‑
R、crRNA和ssDNA
‑
FQ；所述ssDNA
‑
FQ的具体序列为：FAM
‑5’‑
TTTTTT
‑3’‑
TAMRA；2)制备模板将核酸样品加入裂解液，室温下，剧烈混匀5
‑
10秒，静置1
‑
3分钟，取上清液，即可完成模板的制备；其中，所述核酸为DNA时，裂解液中含有：终浓度为0.45
‑
0.55M的NaOH和9.5
‑
10mM的Na2EDTA；所述核酸为RNA时，裂解液中含有：终浓度为2
‑
5U/μL的RNase抑制剂、0.45
‑
0.55M的NaOH和9.5
‑
10mM的Na2EDTA；3)扩增反应将步骤2)制备的模板加入ERA
‑
Cas 12a反应体系中，37℃保温50
‑
60min，完成核酸的扩增反应；4)荧光实时检测在步骤3)的扩增反应过程中，每分钟收集1次荧光值，检测荧光值时，λex＝493nm，λem＝522nm，制作标准样品浓度
‑
最大荧光值标准曲线，根据获得的标准曲线计算待测样品浓度。2.根据权利要求1所述的直扩ERA偶联CRISPR/cas12a的核酸一步实时检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述ERA
‑
Cas12a反应体系中各物质的终浓度为：上游引物ERA
‑
F 0.1
‑
0.3μM、下游引物ERA
‑
R 0.1
‑
0.3μM、crRNA 15.6
‑
62.5nM、ssDNA
‑
FQ 25
‑
100nM、Lbcas12a 25
‑
100nM和激活剂280mM Mg(OAc)2溶液。3.一种金黄色葡萄球菌的直扩ERA偶联CRISPR/cas12a检测方法，包括以下步骤：1)设计引物选取金黄色葡萄球菌的靶基因，GenBankID：CP049528.1，其扩增长度为174bp，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，根据选取的靶基因设计相应的引物，获得上游引物ERA
‑
SAU
‑
F、下游引物ERA
‑
SAU
‑
R、SAU
‑
crRNA和ssDNA
‑
FQ；所述ssDNA
‑
FQ的具体序列为：FAM
‑5’‑
TTTTTT
‑3’‑
TAMRA；2)制备模板将待测金黄色葡萄球菌的DNA样品加入裂解液，室温下，剧烈混匀5
‑
10秒，静置1
‑
3分钟，取上清液，即可完成模板的制备；其中，所述裂解液中含有终浓度为0.45
‑
0.55M的NaOH和9.5
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10mM的Na2EDTA；3)扩增反应将步骤2)制备的模板加入ERA
‑
Cas 12a反应体系中，37℃保温50
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60min，完成DNA的扩增反应；其中，所述ERA
‑
Cas12a反应体系中包括：上游引物ERA
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SAU
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F 0.1
‑
0.3μM、下游引物ERA
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SAU
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R 0.1
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0.3μM、SAU
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crRNA 15.6
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62.5nM、ssDNA
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FQ 25
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100nM、Lbcas12a 25
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100nM和激活剂280mM Mg(OAc)2溶液；4)荧光实时检测
在步骤3)的扩增反应过程中，每分钟收集1次检测荧光值时，λex＝493nm，λem＝522nm，荧光值，先制作标准样品浓度
‑
最大荧光值标准曲线，再根据获得的标准曲线计算待测样品浓度。4.根据权利要求3所述金黄色葡萄球菌的直扩ERA偶联CRISPR/cas12a检测方法，其特征在于，步骤1)中设计的引物从5
’
到3
’
，具体核苷酸序列如下：ERA
‑
SAU
‑
F:5
’‑
CAGCTCCACAGAGTACAGATGCAAGTAATAAAG
‑3’
；ERA
‑
SAU
‑
R:5
’‑
CTCCAGAGTCAATACCAACTGTCACATTCGTCA
‑3’
；SAU
‑
crRNA:5
’‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUUUAGCGGCUGUAGCUGCA
‑3’
。5.根据权利要求4所述金黄色葡萄球菌的直扩ERA偶联CRISPR/cas12a检测方法，其特征在于，所述ERA
‑
Cas 12a反应体系的总体积为20μL，各成分的终浓度为：ERA
‑
SAU
‑
F和ERA
‑
SAU
‑
R各0.1μM、Reaction Buffe...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵凯，杨丹，浦心祎，赵斌安，赵悦琪，史斌，赵桓震，祖刘静，
申请(专利权)人：上海博满生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：