人ApoC1全长蛋白在制备孤独症诊断试剂盒中的应用及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供人ApoC1全长蛋白在制备孤独症诊断试剂盒中的应用及试剂盒，所述试剂盒以人ApoC1全长蛋白为血清检测标志物，结果表明，与正常人相比，孤独症患者的血清中ApoC1全长蛋白含量降低，以此可以用于孤独症的诊断。以此可以用于孤独症的诊断。

【技术实现步骤摘要】
人ApoC1全长蛋白在制备孤独症诊断试剂盒中的应用及试剂盒


[0001]本专利技术涉及试剂盒领域，具体为人ApoC1全长蛋白在制备孤独症诊断试剂盒中的应用及试剂盒。

技术介绍

[0002]孤独症在临床上是一种广泛性的发育障碍性疾病，其主要临床表现是社会交往障碍，兴趣范围刻板、狭窄，而且患者的语言交流功能发育障碍，孤独症的早期诊断有利于早期干预。
[0003]专利文献ZL201610096458.0公开了一种孤独症血清多肽标志物APOC1
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A及其应用，其公开了APOC1
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A多肽可作为血清标志物用于孤独症的诊断。正常人体中含有一定含量的ApoC1全长蛋白，ApoC1全长蛋白部分分解代谢成为各个多肽化合物，其中ApoC1
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A短肽是其中一个重要的代谢产物，该专利文献公开当儿童患有孤独症，ApoC1
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A短肽显著高表达。但是由于ApoC1全长蛋白的分解产物较多，在检测结合ApoC1
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A短肽时，很可能会结合其他的多肽，导致检测结构不准确。并且依据传统的理论，测定血清样本中的ApoC1短肽水平前，需要将血清中ApoC1全长蛋白全部去除，无形中增加了检测操作的难度和主观误差。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供人ApoC1全长蛋白在制备孤独症诊断试剂盒中的应用及试剂盒，所述试剂盒以人ApoC1全长蛋白为血清检测标志物，检测结果更加准确可靠。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案来实现：
[0006]人ApoC1全长蛋白在制备孤独症诊断试剂盒中的应用。
[0007]与人ApoC1全长蛋白相结合的分子在制备孤独症诊断试剂盒中的应用。
[0008]优选的，所述与人ApoC1全长蛋白相结合的分子为兔抗人ApoC1多抗。
[0009]检测人血清中ApoC1全长蛋白的试剂盒，包括：抗人ApoC1
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A短肽单克隆抗体和兔抗人ApoC1多抗。
[0010]优选的，还包括辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗。
[0011]优选的，还包括包被缓冲液，包被缓冲液为0.05mol/L的Na2CO3‑
NaHCO3溶液，pH为9.6。
[0012]优选的，抗人ApoC1
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A短肽单克隆抗体是以人ApoC1
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A短肽为抗原，采用杂交瘤技术制备得到，人ApoC1
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A短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]优选的，使用时，采用双抗夹心酶联免疫吸附实验法测定人血清中的ApoC1全长蛋白。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：
[0015]本专利技术认为孤独症患者的血清中ApoC1全长蛋白部分分解为多肽，这会导致其血
Lys Val Lys Glu Lys Leu Lys Ile Asp Ser，如SEQ ID NO.1所示。
[0026]步骤2，免疫小鼠血清效价测定
[0027]包被人ApoC1
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A短肽10ug/ml于酶标板，4℃过夜，0.15M PBS
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Tween 20洗涤3次，将免疫小鼠血清用0.1％的BSA稀释，稀释度分别为1：1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000，加入酶标板，最后一孔只加0.1％的BSA作对照，37，1h；0.15M PBS
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Tween 20洗涤3次后加入HRP标记的羊抗小鼠抗体，1：5000稀释，100u/孔，37℃作用45min；0.15M PBS
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Tween 20洗涤3次后加入ABTS显色液100u/孔，室温10min测定405nm的吸光值。
[0028]结果如表1所示，结果显示：1、3、4号小鼠效价达到1：64000以上，可以进行细胞融合。
[0029]表1免疫小鼠血清效价
[0030][0031]步骤3，细胞融合
[0032]细胞融合前3d腹腔注射加强免疫。融合前1d，无菌取BALB/c小鼠脾脏，研磨，1350rpm离心7min，弃上清，脾细胞用40ml含20％小牛血清的RPMI 1640重悬，100μl/孔铺入96孔细胞培养板4板，置37℃，5％CO2，相对饱和湿度培养箱中备用。离心收集处于对数生长期的骨髓瘤SP2/0细胞，总数为5～6
×
107，弃上清，以不完全RPMI 1640洗涤1次。取对数生长的骨髓瘤细胞Sp2/0，1350rpm，25℃，离心7min，弃上清，不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，不完全培养液洗涤2次，1350rpm离心7min，弃上清，用滴管吸净残留液体，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略为松动。在室温下融合，30s内加入37℃预热的1ml 45％PEG，边加边搅拌，之后作用90s，加37℃预热的不完全培养液20ml，终止PEG作用。1000rpm离心6min，弃上清，用40ml 20％小牛血清RPMI 1640轻轻混悬，将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，置37℃，5％CO2，相对饱和湿度培养箱中培养。在融合24小时后，每孔加入5
×
HAT选择培养液50μl，3天后换液1次，改为1
×
HAT/HT选择培养液，3天后再次换液，改用1
×
HT培养液。第3次换液后3d，间接ELISA检测阳性克隆：分别包被人ApoC1
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A短肽和BSA，取细胞培养上清进行间接ELISA检测，保留ApoC1
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A短肽阳性且BSA阴性的克隆。
[0033]步骤4，杂交瘤细胞的建系和冻存
[0034]选取ELISA测定结果阳性的克隆进行克隆化。无菌取Balb/c小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，用80ml含20％小牛血清和2
×
HT的RPMI 1640重悬，100μl/孔铺入96孔细胞培养板，置37℃，5％CO2，相对饱和湿度培养箱中备用。将杂交瘤细胞调整密度至10个/ml，100μl/孔铺入已加入脾细胞悬液的96孔细胞培养板，置37℃，5％CO2，相对饱和湿度培养箱中培养6～7天后待克隆长出后再次检测，连续克隆化直至连续2次100％阳性。挑取阳性比较强的克隆
扩大培养建系和冻存，留取培养上清分装于
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20℃冻存待检测和培养足量细胞以制备腹水。
[0035]步骤5，抗人ApoC1
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A短肽单克隆抗体的制备
[0036]依实验室常规融合并筛选获得16株稳定分泌抗人ApoC1
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A短肽mAb杂交瘤细胞系并制备腹水。包被人ApoC1
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A短肽，间接ELISA检测腹水效价为10
‑5～l0...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人ApoC1全长蛋白在制备孤独症诊断试剂盒中的应用。2.与人ApoC1全长蛋白相结合的分子在制备孤独症诊断试剂盒中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述与人ApoC1全长蛋白相结合的分子为兔抗人ApoC1多抗。4.检测人血清中ApoC1全长蛋白的试剂盒，其特征在于，包括：抗人ApoC1
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A短肽单克隆抗体和兔抗人ApoC1多抗。5.根据权利要求4所述的检测人血清中ApoC1全长蛋白的试剂盒，其特征在于，还包括辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗。6.根据权利要求4所述的检测人血清中ApoC1全长蛋白的试剂盒，其特征在于，还包括包被缓冲液，包被缓冲...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯粤峰，罗狄锋，张旭辉，黄辰，胡杰，
申请(专利权)人：广东辰辉生物医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：