一种黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法及应用，包括如下步骤：选择芳香族氨基酸、支链氨基酸，以及L

【技术实现步骤摘要】
一种黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物化工
具体是一种黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]痛风是一种以高尿酸血症为主要危险因素的慢性疾病，是由于尿酸生成过量或排泄紊乱，导致尿酸盐晶体在滑膜、滑囊、软骨等关节组织沉积而引起。据统计，痛风在世界范围内的发病率为0.06％
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2.68％，在我国仅次于II型糖尿病的发病率，是最普遍、最严重的代谢疾病之一，危害人们的健康。临床上应用的抗痛风药物有别嘌呤醇、非布司他、秋水仙碱等抑制尿酸生成或促进尿酸排泄的药物。然而，这些化学药物的肾毒性、皮炎、过敏反应等毒副反应给痛风患者带来健康隐患。目前迫切需要开发更多绿色健康和安全的抗痛风药物。从天然存在的蛋白质中提取的降尿酸肽，通过抑制黄嘌呤氧化酶(以下文中简写为XOD)的活性减少尿酸的生成，或促进尿酸在肾脏的排泄达到治疗痛风或高尿酸血症的目的，具备天然低毒、易吸收和补充营养的优势，是更加绿色健康的治疗和预防方式。
[0003]目前制备多肽的方法有三种：化学合成法、蛋白酶水解法和非水相酶法。以固相合成法为代表的化学合成法历史悠久，通常作为验证新肽的标准方法，但是，保护碱基和脱保护步骤繁琐，而且多周期和复杂的纯化过程也阻碍了其大规模的工业应用。蛋白酶水解法是从蛋白质中制备功能性多肽应用最广泛的方法，但缺点是水解过程不可控、目标肽含量低、纯化成本高、蛋白提取率低等。近年来发展起来的非水相酶法合成多肽，通过抑制多肽水解反应并促进肽的合成、在提高反应特异性和易于溶剂工程调控等方面具有无可比拟的优势。目前为止，还未有关于在非水相介质中利用蛋白酶合成抗痛风肽或降尿酸肽的研究报道。
[0004]如表1所示，目前已报道的降尿酸肽共33种(共117个氨基酸)，氨基酸残基从2个到9个不等，降尿酸肽通过抑制XOD活性而减少尿酸的生成。从中可以看出降尿酸肽主要为芳香族氨基酸(AAAs)和支链氨基酸(BCAAs)，其中色氨酸含量为17％、脯氨酸8.5％、丙氨酸9.4％、苯丙氨酸6.8％、亮氨酸6％、酪氨酸5.1％和组氨酸5.1％。研究表明，疏水肽比亲水性肽更容易进入XOD活性部位，它们能够阻断XOD与底物黄嘌呤的结合，疏水性氨基酸与XOD活性位点氨基酸残基的相互作用更强。因此，以降尿酸肽中含量丰富的芳香族氨基酸、疏水氨基酸残基和亲水性氨基酸为原料，非水相酶催化合成多肽库，将是高效制备新型XOD抑制肽的一个可行策略。
[0005]表1 降尿酸肽的序列组成，抑制效果和作用机制
[0006][0007]
技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法及应用，选择芳香族氨基酸、支链氨基酸，以及L
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脯氨酸和L
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组氨酸作为原料，利用蛋白酶在非水相介质中制备黄嘌呤氧化酶抑制肽，获取的一种黄嘌呤氧化酶抑制肽序列为Phe
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Trp
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Phe，单字母简写为FWF，能够持续稳定地抑制黄嘌呤氧化酶的活性。
[0009]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，包括以下步骤：
[0010](1)选择L
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色氨酸、L
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苯丙氨酸、L
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酪氨酸、L
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亮氨酸、L
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丙氨酸、L
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脯氨酸和L
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组氨酸作为原料，以蛋白酶为催化剂在非水相介质中合成黄嘌呤氧化酶抑制肽，筛选出合成抑制肽效果好的氨基酸组合是L
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色氨酸和L
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苯丙氨酸、L
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色氨酸和L
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组氨酸、L
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酪氨酸和L
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丙氨酸、L
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酪氨酸和L
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脯氨酸、L
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组氨酸和L
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组氨酸、L
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组氨酸和L
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脯氨酸、L
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脯氨酸和L
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酪氨酸；
[0011](2)采用响应面法优化黄嘌呤氧化酶抑制肽合成的反应条件：三乙胺浓度为1～370mmol/L，pH为5.5～7.5，反应时间为1～3h，氨基酸浓度为0.001～100mmol/L，蛋白酶的添加量为0.1～8U/mL；
[0012](3)黄嘌呤氧化酶抑制肽的分离纯化及其质谱鉴定；
[0013](4)黄嘌呤氧化酶抑制肽的化学合成和抑制活性验证；
[0014](5)采用分子对接的方法验证黄嘌呤氧化酶的抑制机理。
[0015]步骤(1)所述的筛选出合成抑制肽效果好的氨基酸组合还有L
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色氨酸和L
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苯丙氨酸、L
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色氨酸和L
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组氨酸、L
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组氨酸和L
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组氨酸、L
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脯氨酸和L
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酪氨酸。
[0016]步骤(1)中采用的氨基酸组合为L
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色氨酸和L
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苯丙氨酸。
[0017]步骤(2)中条件为：60mmol/L色氨酸，60mmol/L苯丙氨酸，8U/mL木瓜蛋白酶，90mmol/L三乙胺，pH 6.0，反应1.5h。
[0018]步骤(2)中所述的采用响应面法优化黄嘌呤氧化酶抑制肽合成的反应条件是90mmol/L三乙胺，pH 6.0，反应1.5h，氨基酸浓度为60mmol/L，蛋白酶的添加量为8U/mL。
[0019]所述制备的黄嘌呤氧化酶抑制肽为Phe
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Trp
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Phe，单字母简写为FWF，抑制率为20.69％，能够持续稳定地抑制黄嘌呤氧化酶的活性。
[0020]所述黄嘌呤氧化酶抑制肽的分离纯化及其质谱鉴定是采用高效液相色谱法分离纯化，用LC
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MS/MS对抑制肽进行序列鉴定。
[0021]所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法制备得到的黄嘌呤氧化酶抑制肽在制备预防和治疗痛风药物中的应用。
[0022]所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法制备得到的黄嘌呤氧化酶抑制肽在制备预防和治疗高尿酸血症药物的中的应用。
[0023]所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法制备得到的黄嘌呤氧化酶抑制肽在功能性食品添加剂中的应用。
[0024]所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法制备得到的黄嘌呤氧化酶抑制肽的应用，包括如下步骤：
[0025](1)选择L
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色氨酸、L
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苯丙氨酸、L
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酪氨酸、L
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亮氨酸、L
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丙氨酸、L
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脯氨酸和L
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组氨酸作为原料，两两配对组合，检测所有49种组合在非水相中合成肽对XOD的抑制活性，筛选出抑制效果最优的氨基酸组合L...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选择L
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色氨酸、L
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苯丙氨酸、L
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酪氨酸、L
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亮氨酸、L
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丙氨酸、L
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脯氨酸和L
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组氨酸作为原料，以蛋白酶为催化剂在非水相介质中合成黄嘌呤氧化酶抑制肽，筛选出合成抑制肽的氨基酸组合是L
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色氨酸和L
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苯丙氨酸、L
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色氨酸和L
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组氨酸、L
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酪氨酸和L
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丙氨酸、L
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酪氨酸和L
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脯氨酸、L
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组氨酸和L
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组氨酸、L
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组氨酸和L
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脯氨酸、L
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脯氨酸和L
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酪氨酸；(2)采用响应面法优化黄嘌呤氧化酶抑制肽合成的反应条件：三乙胺浓度为1～370mmol/L，pH为5.5～7.5，反应时间为1～3h，氨基酸浓度为0.001～100mmol/L，蛋白酶的添加量为0.1～8U/mL；(3)黄嘌呤氧化酶抑制肽的分离纯化及其质谱鉴定；(4)黄嘌呤氧化酶抑制肽的化学合成和抑制活性验证；(5)采用分子对接的方法验证黄嘌呤氧化酶的抑制机理。2.根据权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的筛选出合成抑制肽效果好的氨基酸组合还有L
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【专利技术属性】
技术研发人员：王成华，黄晓妮，张艳梅，文佑，姜毅，廖佳珺，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：