新型dsRNA聚合物纳米载体的制备方法及其制备的纳米载体和应用技术

本发明专利技术公开新型dsRNA聚合物纳米载体的制备方法，涉及农药纳米载体的制备技术领域，是基于传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后无法及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题提出的。本发明专利技术还提供上述新型dsRNA聚合物纳米载体的制备方法制得的纳米载体，纳米载体的结构式为：本发明专利技术还提供上述新型dsRNA聚合物纳米载体的制备方法制得的纳米载体在虫害防治领域的应用。本发明专利技术所构筑的荧光纳米载体很好的解决了传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后无法及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题，由于生物体内都存在着大量ATP，而本发明专利技术的荧光纳米载体碰到ATP就会破裂开来，从而将包裹的物质释放出来。从而将包裹的物质释放出来。从而将包裹的物质释放出来。

【技术实现步骤摘要】
新型dsRNA聚合物纳米载体的制备方法及其制备的纳米载体和应用


[0001]本专利技术涉及农药纳米载体的制备
，具体涉及新型dsRNA聚合物纳米载体的制备方法及其制备的纳米载体和应用。

技术介绍

[0002]植物虫害是制约现代农作物产量和质量的重要因素，全球每年因虫害所造成的农作物减产量约占总产量的30％
‑
40％。作物的害虫防治作为一种提高粮食产量的方法而成为了当前广受关注的前沿研究方向。传统化学农药导致了有害虫抗药性、农药残留超标、环境严重污染等一系列问题，严重影响了我国农产品质量安全、农业生态环境安全以及害虫的可持续防控。相较于化学农药，利用RNAi技术对植物虫害进行防治具有显著的优势：既不会对环境和人体造成伤害也不会使害虫产生抗药性。文献《RNA干扰技术在植物品质改良和病虫害防治中的应用》([J].浙江农业科学,2014,1(006):0
‑
886.)应用RNAi技术改良植物营养品质和控制病虫害。但dsRNA因自身的结构特性造成dsRNA在消化系统内易被酶解，且不易穿透细胞膜。这两点原因造成裸露的dsRNA在虫害细胞内RNAi效果差，效率低。纳米材料因其独特的结构、尺寸和理化性质在基因、药物的运载和靶向释放领域受到了广泛的关注。利用纳米载体对dsRNA进行运载可以有效提高dsRNA的穿膜能力以及增强其稳定性。当前，常用的dsRNA纳米载体主要有无机纳米粒子、表面活性剂以及阳离子型聚合物。国内外研究表明利用这些纳米粒子负载dsRNA可以有效的提高RNAi效率效果。/>[0003]传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后如何及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题一直没有解决，这也导致了通过聚合物纳米运载dsRNA在虫害体内的RNAi效率不高。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题在于解决传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后无法及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题。
[0005]本专利技术通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
[0006]新型dsRNA聚合物纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
[0007](1)制备PFPMA单体
[0008]分别称取1当量重的五氟苯酚(PFP)、1
‑
1.5当量重的三乙胺和1
‑
2当量重的丙烯酰氯，先将五氟苯酚用四氢呋喃溶解，加入催化剂搅拌均匀，然后在氮气保护下加丙烯酰氯，在室温下反应4h后处理得到PFPMA；五氟苯酚(PFP)易于合成五氟代苯基活性酯，且易于发生聚合；
[0009](2)制备PEG2k
‑
CTA
[0010]分别称取3当量重的可逆加成断裂链转移剂CTA、4当量重的聚乙二醇单甲醚、3当量重1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和0.4当量重的4
‑
二甲氨基吡啶并溶解在二氯甲烷里，70℃回流反应过夜；采用柱层析法进行纯化，在真空烘箱中室温干燥一夜，
得到淡黄色固体PEG2k
‑
CTA；链转移剂PEG2K
‑
CTA一端接有PEG链段，使其具有两亲性，可以在水中自组装；
[0011](3)称取不同比例的PFPMA和PEG2k
‑
CTA溶于四氢呋喃中，加入聚合引发剂于安瓿瓶中，冻融循环3次，充入氮气，70℃反应24h后处理得到PFn；
[0012](4)分别称取1当量重的罗丹明和10
‑
20当量重的二乙烯三胺，将罗丹明和二乙烯三胺加入反应溶剂中溶解后，70℃回流反应24h后处理得到单体R；二乙烯三胺通过与罗丹明B产生一个螺旋的内酰胺环，进而破环了其共轭结构，抑制了罗丹明B荧光的发生；
[0013](5)制备荧光纳米载体PR
[0014]分别称取1当量重的PFn、1
‑
2当量重的R和0.1
‑
0.2当量重的活化剂，依次溶于N,N
‑
二甲基甲酰胺中，室温反应24h后处理得到PR，即为新型dsRNA聚合物纳米载体。
[0015]所述新型dsRNA聚合物纳米载体的制备路线如下：
[0016][0017]本专利技术所构筑的荧光纳米载体很好的解决了传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后无法及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题，由于生物体内都存在着大量ATP，而本专利技术的荧光纳米载体碰到ATP就会破裂开来，从而将包裹的物质释放出来。
[0018]优选地，所述步骤(1)中催化剂为三乙胺。
[0019]优选地，所述步骤(2)中聚乙二醇单甲醚的平均分子量为2000。
[0020]优选地，所述步骤(2)中柱层析的溶剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1。
[0021]优选地，所述步骤(3)中聚合引发剂为偶氮二异丁腈。
[0022]优选地，所述步骤(3)中引发剂和单体的比例为1:30。
[0023]优选地，所述步骤(4)中反应溶剂为乙醇。
[0024]优选地，所述步骤(5)中聚活化剂为1
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乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸
盐。
[0025]本专利技术还提供上述制备方法制得的纳米载体材料，所述纳米载体材料的结构式如下式所示：
[0026][0027]本专利技术还提供上述新型dsRNA聚合物纳米载体的制备方法制得的纳米载体在虫害防治领域的应用。
[0028]本专利技术具有如下的有益效果：
[0029]1、本专利技术所构筑的荧光纳米载体很好的解决了传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后无法及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题，由于生物体内都存在着大量ATP，而本专利技术的荧光纳米载体碰到ATP就会破裂开来，从而将包裹的物质释放出来。
[0030]2、本专利技术通过可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)将五氟苯酚单体与链转移剂(PEG2k
‑
CTA)共聚，获得各种比例的新型高分子，然后再用疏水荧光基团R替换掉五氟苯酚部分，这种聚合物具有两亲性和生物相容性。
[0031]3、相较于传统的纳米载体，本专利技术利用ATP的磷酸基团与多个氨基之间的氢键作用来打开螺旋内酰胺环，使得该纳米载体具有良好的荧光性能和实时定位，以便更好地确认载体包裹的物质是否到达目标位置。
附图说明
[0032]图1为本专利技术实施例制备的PFPMA单体的核磁氢谱图；
[0033]图2为本专利技术实施例制备的PEG2k
‑
CTA的核磁氢谱图；
[0034]图3为本专利技术实施例制备的PFPMA单体核磁碳谱图；
[0035]图4为本专利技术实施例制备的PF聚合物的核磁氟谱图；
[0036]图5为本专利技术实施例制备的PEG2k
‑
CTA、聚合物PF和PR的凝胶渗透色谱图；
[0037]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.新型dsRNA聚合物纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备PFPMA单体分别称取1当量重的五氟苯酚、1
‑
1.5当量重的三乙胺和1
‑
2当量重的丙烯酰氯，先将五氟苯酚用四氢呋喃溶解，加入催化剂搅拌均匀，然后在氮气保护下加丙烯酰氯，在室温下反应4h后处理得到PFPMA；(2)制备PEG2k
‑
CTA分别称取3当量重的可逆加成断裂链转移剂CTA、4当量重的聚乙二醇单甲醚、3当量重1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和0.4当量重的4
‑
二甲氨基吡啶并溶解在二氯甲烷里，70℃回流反应过夜；采用柱层析法进行纯化，在真空烘箱中室温干燥一夜，得到淡黄色固体PEG2k
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CTA；(3)称取不同比例的PFPMA和PEG2k
‑
CTA溶于四氢呋喃中，加入聚合引发剂于安瓿瓶中，冻融循环3次，充入氮气，70℃反应24h后处理得到PFn；(4)分别称取1当量重的罗丹明和10
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20当量重的二乙烯三胺，将罗丹明和二乙烯三胺加入反应溶剂中溶解后，70℃回流反应24h后处理得到单体R；(5)制备荧光纳米载体PR分别称取1当量重的PFn、1
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2当量重的R和0.1
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0.2当量重的活化剂，依次溶于N,N
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二甲基甲酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光，毕飞虎，韦曾明，李鸿宇，任慧，于得水，黄渤，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：