一株高效利用甲酸的扭脱甲基杆菌进化菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株高效利用甲酸的扭脱甲基杆菌进化菌及其应用，该进化菌以甲酸作为辅助原料，在不同比例甲醇和甲酸作为混合碳源的培养条件下，高效合成3

【技术实现步骤摘要】
Methylorubrum extorquens AM1FT07，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021 年11月11日，保藏号为CCTCC M 20211396，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路 299号。
[0007]上述扭脱甲基杆菌进化菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0008]将权利要求1所述的扭脱甲基杆菌进化菌接种在甲醇和甲酸作为混合碳源的Hypho培养 基上，29
‑
31℃摇瓶培养，即可获得高效利用甲酸的扭脱甲基杆菌进化菌的发酵液。
[0009]进一步的，上述步骤1)中所述的甲醇和甲酸作为混合碳源的Hypho培养基的制备方法， 包括如下步骤：
[0010]S1配制大量元素A溶液：在水中添加K2HPO4和NaH2PO4，K2HPO4的终浓度为5
‑
5.2g/L， NaH2PO4的终浓度为2.4
‑
2.6g/L；
[0011]S2配制大量元素B溶液：在水中添加MgSO4·
7H2O和(NH4)2SO4，MgSO4·
7H2O的终浓 度为0.3
‑
0.5g/L，(NH4)2SO4的终浓度为0.8
‑
1g/L；
[0012]S3配制微量元素A溶液：在水中添加Na2EDTA和FeSO4·
7H2O，Na2EDTA的终浓度为 8
‑
10g/L，FeSO4·
7H2O终浓度为0.8
‑
1g/L，用1M NaOH调pH至3
>‑
4；
[0013]S4配制微量元素B溶液：在水中添加CaCl2·
2H2O、MnCl2·
4H2O、Na2MoO4·
2H2O、 CuSO4·
5H2O、CoCl2·
6H2O、ZnSO4·
7H2O，CaCl2·
2H2O的终浓度为1.2
‑
1.6g/L，MnCl2·
4H2O 终浓度为0.5
‑
1g/L，Na2MoO4·
2H2O的终浓度为0.2
‑
0.5g/L，CuSO4·
5H2O的终浓度为0.2
‑
0.5g/L， CoCl2·
6H2O的终浓度为1.2
‑
1.8g/L，ZnSO4·
7H2O的终浓度为4
‑
4.5g/L，用HCl调pH到1
‑
2；
[0014]S5将步骤S1配制的大量元素A溶液和步骤S2配制的大量元素B溶液按照质量比1:1 的比例混合，获得混合溶液；
[0015]S6将步骤S3配制微量元素A溶液和步骤S4配制的微量元素B溶液与步骤S5制备的混 合溶液按照质量比1:1:1000的比例进行混合，再按照比例添加甲醇和甲酸作为碳源，获得甲 醇和甲酸作为混合碳源的Hypho培养基。
[0016]进一步的，上述步骤S6中所述的所述的甲醇和甲酸的摩尔比为0.33:1，总摩尔浓度为 120mM。
[0017]进一步的，上述高效利用甲酸的扭脱甲基杆菌进化菌在作为底盘宿主催化转化甲醇合成 相应有机酸产品中的应用。
[0018]进一步的，上述高效利用甲酸的扭脱甲基杆菌进化菌在作为底盘宿主转化甲醇和甲酸合 成3
‑
羟基丙酸中的应用。
[0019]进一步的，上述应用的方法，包括如下步骤：
[0020]SS1 3
‑
羟基丙酸异源合成途径质粒电转入上述高效利用甲酸的扭脱甲基杆菌进化菌中， 获得3
‑
羟基丙酸生产菌；
[0021]SS2将步骤SS1中获得的3
‑
羟基丙酸生产菌通过两阶段培养工艺转化甲醇和甲酸合成3
‑ꢀ
羟基丙酸。
[0022]有益效果：
[0023]本专利技术提供了一种利用动态梯度控制一碳含能化合物甲酸和甲醇供给比例作为实验室适 应性进化的选择压力，驱动扭脱甲基杆菌基因组发生超突变，获得一株兼顾高耐
受甲酸和高 利用甲酸的进化菌。进化菌在甲醇和甲酸作为混合碳源，或在甲醇、甲酸、乙醇、乙酸、草 酸、丙二醇、丙酮酸和琥珀酸作为唯一碳源，或添加不同浓度的甲醛、3
‑
羟基丙酸、乳酸的 培养条件下，生长速率和生物量得率都显著优于适应性进化前的祖先菌WT
△
cel。所述获得 的进化菌应用于有机酸合成(本案例是3
‑
羟基丙酸)，利用甲酸作为辅助碳源，为进化菌生长 和生产3
‑
羟基丙酸提供所需的额外还原力，优化甲醇和甲酸的摩尔浓度比例能显著提高两种 碳源协同合成3
‑
羟基丙酸的产量和转化率。本专利技术获得的进化菌，为甲醇和甲酸有效协同转 化成有机酸提供了有价值的底盘细胞工厂，为二氧化碳减排和碳资源可持续利用提供了创新 的底盘细胞工厂。
附图说明
[0024]图1扭脱甲基杆菌实验室适应性进化传代培养过程的示意图。
[0025]图2一株进化菌AM1FT07和适应性进化前祖先菌WT
△
cel的透射电镜比较图。
[0026]图3获得的一株进化菌AM1FT07和适应性进化前祖先菌WT
△
cel在甲醇和甲酸作为混 合碳源和甲酸作为唯一碳源下的生长曲线。
[0027]图4一株进化菌AM1FT07和适应性进化前祖先菌WT
△
cel在不同浓度甲醇下的生长曲 线。
[0028]图5一株进化菌AM1FT07和适应性进化前祖先菌WT
△
cel在乙醇、乙酸、草酸、丙二 醇、丙酮酸和琥珀酸作为唯一碳源下的生长曲线。
[0029]图6一株进化菌AM1FT07和适应性进化前祖先菌WT
△
cel在添加不同浓度的甲醛培养 条件下的生长曲线。
[0030]图7一株进化菌AM1FT07和适应性进化前祖先菌WT
△
cel在添加不同浓度的3
‑
羟基丙 酸培养条件下的生长曲线。
[0031]图8一株进化菌AM1FT07和适应性进化前祖先菌WT
△
cel在添加不同浓度的L
‑
型乳酸 培养条件下的生长曲线。
[0032]图9 13
C分析一株进化菌AM1FT07在甲醇和甲酸作为混合碳源(摩尔比例0.33：1，总 浓度120mM)下，细胞内合成的氨基酸分别来源于甲酸和甲醇的百分比例。
[0033]图10一株进化菌AM1FT07和适应性进化前祖先菌WT
△
cel的胞内甲酸脱氢酶FDH和 NADH转氢酶(PntAB)酶活比较。
[0034]图11以进化菌AM1FT07作为底盘细胞构建的3
‑
羟基丙酸生产菌AM1FT07
‑
3HP在添加 不同摩尔浓度比例的甲醇和甲酸下的生长曲线和3...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高效利用甲酸的扭脱甲基杆菌进化菌，其特征在于，所述的扭脱甲基杆菌进化菌命名为Methylorubrum extorquens AM1FT07，保藏号为CCTCC M 20211396。2.如权利要求1所述的扭脱甲基杆菌进化菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的扭脱甲基杆菌进化菌接种在甲醇和甲酸作为混合碳源的Hypho培养基上，29
‑
31℃摇瓶培养，即可获得高效利用甲酸的扭脱甲基杆菌进化菌的发酵液。3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的甲醇和甲酸作为混合碳源的Hypho培养基的制备方法，包括如下步骤：S1配制大量元素A溶液：在水中添加K2HPO4和NaH2PO4，K2HPO4的终浓度为5
‑
5.2g/L，NaH2PO4的终浓度为2.4
‑
2.6g/L；S2配制大量元素B溶液：在水中添加MgSO4·
7H2O和(NH4)2SO4，MgSO4·
7H2O的终浓度为0.3
‑
0.5g/L，(NH4)2SO4的终浓度为0.8
‑
1g/L；S3配制微量元素A溶液：在水中添加Na2EDTA和FeSO4·
7H2O，Na2EDTA的终浓度为8
‑
10g/L，FeSO4·
7H2O终浓度为0.8
‑
1g/L，用1M NaOH调pH至3
‑
4；S4配制微量元素B溶液：在水中添加CaCl2·
2H2O、MnCl2·
4H2O、Na2MoO4·
2H2O、CuSO4·
5H2O、CoCl2·
6H2O、ZnSO4·
7H2O，CaCl2·
2H2O的终浓度为1.2
‑
1.6g/L，MnCl2·

【专利技术属性】
技术研发人员：杨松，朱琳，马增新，张长太，宋琳，宋亚珍，孙静，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：