促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶及生产方法技术

本发明专利技术公开了一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶，纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该酶的序列如SEQ ID NO.2所示；纤维素酶的生产方法，包括：以合成的序列Endo1为模板，进行PCR，获得目的基因；对目的基因和pRSFduet

【技术实现步骤摘要】
促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶及生产方法


[0001]本专利技术涉及动物中药饲料
，更具体地说是涉及一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶及生产方法。

技术介绍

[0002]长期以来，化学药品、抗生素和激素的毒副作用和耐药性一直都是困扰医学专家的重要因素，尤其是容易引起动物产品药物残留，这已成为一个全社会关注的问题。中药的毒副作用小，无耐药性，不会在肉、蛋、奶等畜产品中产生有害残留，是中药添加剂的一个独特优势，这一优势，顺应了时代潮流，满足了人们回归自然、追求绿色食品的愿望。
[0003]中药具有营养和药物的双重作用，其内含有多种成分，包括多糖、生物碱、苷类等。中药在动物肠道内，要发挥药效，活性成分必须从组织中释放出来。但是中药活性成分往往被纤维素等包裹，因此，降解纤维素成为中药有效成分释放的关键。
[0004]现有的纤维素酶虽然能够降解纤维素，但是其在肠道环境下的活性较低，因此，开发在肠道环境温度下具有更高活性的纤维素酶，对中药在肠道环境下的吸收具有中药意义。
[0005]因此，如何提供一种在动物肠道内酶活更好的纤维素酶是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种本在肠道环境温度37℃下具有更高酶活的纤维素内切酶，该内切酶在中药饲料领域具有广阔的市场空间。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶，所述纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶的编码核苷酸序列，所述序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶的生产方法，包括下述步骤：
[0011]1)以合成的序列Endo1为模板，进行PCR，获得目的基因；
[0012]2)对目的基因和pRSFduet
‑
1质粒进行BamHI和EcoRI双酶切，然后连接酶切产物，获得重组质粒pET28a
‑
endo；
[0013]3)将重组质粒pET28a
‑
endo转化至大肠杆菌感受态细胞中，获得转化菌株；
[0014]4)对转化菌株进行诱导培养，离心、取上清、纯化，得纤维素酶。
[0015]作为上述技术方案优选的技术方案，步骤1)中，
[0016]PCR反应体系如下：
[0017][0018]PCR程序如下:
[0019][0020]作为上述技术方案优选的技术方案，步骤2)中，酶切温度为37℃，酶切时间为3h；
[0021]Endo1序列双酶切体系：
[0022][0023]Pet28a双酶切体系：
[0024][0025]作为上述技术方案优选的技术方案，，步骤2)中，连接酶切产物的体系包括：将Endo1和质粒酶切产物按3：1比例加入，并与1μL T4 DNA连接酶混匀，在16℃下连接过夜，获得pET28a
‑
endo。
[0026]作为上述技术方案优选的技术方案，步骤3)中，诱导、离心、取上清培养包括：
[0027](1)将转化菌株接种于6mL含50mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃220rpm过夜培养14h；
[0028](2)按1:100将种子转接至500mL LB培养基，37℃150rpm培养至OD
600
＝0.5；用0.7mM的IPTG诱导基因的表达，诱导后18℃150rpm过夜培养24h；
[0029](3)4000g 4℃离心5min收集菌体，用30mL保存缓冲液重悬菌体，然后破碎菌体；破碎后的细胞悬浮液12000rpm 4℃离心30min，所得上清即为蛋白粗酶液。
[0030]作为上述技术方案优选的技术方案，步骤3)中，纯化的过程为：
[0031](1)将6mL Ni
‑
NTA纯化介质加入到50mL空的层析柱中，让介质自由沉降，并放干储存液；
[0032](2)加入4倍柱体积的洗涤缓冲液平衡层析介质；
[0033](3)将蛋白粗酶液上样至柱中，流速控制为0.5mL/min；
[0034](4)以流速为1mL/min的洗涤缓冲液洗涤柱子，10倍柱体积的流量去除杂蛋白；
[0035](5)用5倍柱体积洗脱缓冲液以0.5
‑
1mL/min的流速洗脱，收集洗脱液；
[0036](6)收集目的蛋白洗脱液，用Millipore超滤管对纯化后的蛋白进行脱盐浓缩，用保存缓冲液置换含咪唑的洗脱缓冲液。
具体实施方式
[0037]下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0038]实施例1
[0039]材料
[0040]E.coli DH5а，实验室保藏；限制性内切酶，TakaRa公司；质粒提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；即用型易错PCR试剂盒，北京天恩泽科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，福州奥研实验器材有限责任公司；质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；质粒pET28a实验室保存；序列Endo1基因全合成，擎科生物有限公司合成；羟甲基纤维素钠(CMCNa)上海源叶生物科技有限公司；
[0041]Primer F1:GGATCCATGGCTACTC GCCTGAT；SEQ ID NO.3所示；
[0042]Primer R1:GAATTCTTAGTGGTGGTGATGAT；SEQ ID NO.4所示。
[0043]擎科生物有限公司合成。
[0044]方法
[0045]易错PCR
[0046]以合成的引物PrimerF和Primer R1为引物，以合成的序列Endo1为模板，进行易错PCR.易错PCR反应体系如下：
[0047][0048][0049]易错PCR程序如下:
[0050][0051]酶切和转化
[0052]获得目的基因和pRSFduet
‑
1表达载体后，分别在PCR小管中加入双蒸水、内切酶缓冲液、酶切底物、限制性内切酶，进行双酶切反应，加入顺序从多到少。目的基因和pRSFduet
‑
1置于37℃下进行双酶切，反应体系如下：
[0053]合成Endo1序列双酶切体系：
[0054][0055]Pet28a双酶切体系：
[0056][0057]使用BamHI和EcoRI限制性内切酶在37℃下进行双酶切反应3h后，加入Loading Buffer终止反应，并根据照凝胶回收试剂盒说明书纯化、回收双酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶，其特征在于，所述纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶的编码核苷酸序列，其特征在于，所述序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶的生产方法，其特征在于，包括下述步骤：1)以合成的序列Endo1为模板，进行PCR，获得目的基因；2)对目的基因和pRSFduet
‑
1质粒进行BamHI和EcoRI双酶切，然后连接酶切产物，获得重组质粒pET28a
‑
endo；3)将重组质粒pET28a
‑
endo转化至大肠杆菌感受态细胞中，获得转化菌株；4)对转化菌株进行诱导培养，离心、取上清、纯化，得纤维素酶。4.根据权利要求3所述的一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶的生产方法，其特征在于，步骤1)中，PCR反应体系如下：PCR程序如下:5.根据权利要求3所述的一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶的生产方法，其特征在于，步骤2)中，酶切温度为37℃，酶切时间为3h；Endo1序列双酶切体系：
Pet28a双酶切体系：6.根据权利要求3所述的一种促进中药饲料添加剂在肠道释放的纤维素酶的生产方法，其特征在于，步骤2)中，连接酶切产物的体系包括：将Endo1和质粒酶切产物按3：1比例加入，并与1μL T4 DNA连接酶混匀，在16℃下连接过夜，获得pET28a...

【专利技术属性】
技术研发人员：游锡火，王玉万，薛栋升，蒋慧，梁大明，田美华，胡燕，夏胜，王伟，任雅楠，于晶晶，刘佳丽，孙赫，孙哲，刘艳辉，曾徐浩，张耀，齐义清，沈力，游王丹，
申请(专利权)人：中农华威生物制药湖北有限公司，
类型：发明
国别省市：