一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用。本发明专利技术以GH5

【技术实现步骤摘要】
一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法及突变体、基因和应用。

技术介绍

[0002]非淀粉多糖（non
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starch polysaccharide, NSP）是植物中除了淀粉之外的碳水化合物的总称，包括纤维素、半纤维素和果胶类等。饲料纤维中含有大量的NSP，不仅会影响动物的正常消化功能，妨碍动物吸收营养，还严重降低了饲料的利用效率。非淀粉多糖酶，包括纤维素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等，可以有效将饲料中的NSP降解成小分子，降低NSP的抗营养作用，提高饲料营养价值并改善动物生长性能。一般情况下，饲料中非淀粉多糖的降解需要纤维素酶、半纤维素酶（β
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1,3
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葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶）共同作用，所以非淀粉多糖酶在饲料中需要复合使用，但这无疑增加了饲料成本，成为限制其广泛应用的一个重要因素。因此，双功能NSP酶（一种酶同时具有两种或以上功能）的研究与应用是简化饲料加工工艺、降低饲料成本的有效途径，获得功能多样性且高效的双功能酶对工业应用更是意义巨大。
[0003]催化活性作为衡量酶工业化应用价值的重要指标，也是研究工作者的重点。许多单结构域的双功能酶都共享着催化通道内的催化残基与大部分底物结合位点，由于这些底物结合位点之间在功能上存在着平衡与制约，因此，双功能酶催化活性的改造存在着更大的挑战，如何有选择性的提高一种活性或者多种活性是研究者不断追求的目标。在当前的蛋白质工程领域研究中，提高催化效率的方法主要为理性设计、半理性设计与定向进化。由于随机突变具有太大的随机性，因此不适合这种精确的靶向改造。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种提高双功能纤维素酶的催化效率的方法。
[0005]本专利技术再一目的是提供双功能纤维素酶突变体。
[0006]本专利技术再一目的是提供双功能纤维素酶突变体的编码基因。
[0007]本专利技术的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
[0008]本专利技术的再一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0009]本专利技术的再一目的是提供一种制备催化效率提高的双功能纤维素酶的方法。
[0010]本专利技术的再一目的是提供上述双功能纤维素酶突变体的应用。
[0011]本专利技术以GH5
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5家族Bispora sp. MEY
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1来源的具有纤维素酶与甘露聚糖酶活性的双功能纤维素酶BsCel5B作为母本，发现位点Thr100对酶的双功能特性有着重要的影响。突变为Thr100Asn与Thr100Cys后，可获得纤维素酶活性提高突变体；突变为Thr100Ile、Thr100Leu、Thr100Val和Thr100Ser后，可获得的甘露聚糖酶活性提高的突变体。在此改造条件下，纤维素酶突变体对纤维素底物的比活力最高比突变前提高了150%，甘露聚糖酶比
活力最多提高了81%。突变体更为优越的双功能的特性比野生型有着更为广阔的应用空间，也奠定了其在工业生产领域的应用前景。
[0012]GH5
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5家族Bispora sp. MEY
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1来源的双功能纤维素酶BsCel5B的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 GH5
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5家族Bispora sp. MEY
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1来源的双功能纤维素酶BsCel5B的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B
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M1（T100N，Thr100Asn）氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0013]所述催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B
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M1核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0014]所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B
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M2(T100I，Thr100Ile)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0015]所述催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B
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M2核酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0016]所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B
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M3(T100L，Thr100Leu)氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B
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M3氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0017]所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B
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M4(T100V，Thr100Val)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0018]所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B
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M4氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
[0019]所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B
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M5(T100C，Thr100Cys)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
[0020]所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B
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M5氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
[0021]所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B
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M6(T100S，Thr100Ser)氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
[0022]所述纤维素酶催化活性提高的纤维素酶突变体BsCel5B
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M6氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
[0023]根据本专利技术的具体实施方式，对野生型的双功能纤维素酶BsCel5B 的T100位点实施定点突变，获得T100N、T100I、T100L、T100V、T100C和T100S突变体，将包含突变体基因的重组载体转化毕赤酵母GS115，通过对小管水平的发酵液进行酶活测定初步筛选阳性转化子。对酶活最高的转化子进行大瓶诱导，并对粗酶液进行蛋白浓缩及纯化。利用SDS
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PAGE电泳检测纯化后突变体和野生型的纯度。以纯化后的蛋白为对象，利用DNS法测定野生型与突变体的基本酶学性质。结果表明，与野生型相比，突变体酶促反应的最适pH值、最适温度并未发生变化；以羧甲基纤维素钠为底物时，突变体M1与M5的比活力比BsCel5B提高了150%和30%，突变体M2、M3、M4与M6的甘露聚糖比活力较野生型提高了12%、81%、38%和56%。
[0024]本专利技术还提供了一种制备催化效率提高的双功能纤维素酶的方法，包括以下步骤：1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2）培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；3）回收并纯化所表达的催化效率提高的纤维素酶。
[0025]本专利技术证明并确认了所提供的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高双功能纤维素酶对纤维素底物的催化效率的方法，其特征在于，所述方法包括将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型的双功能纤维素酶的第100为氨基酸由Thr突变为Asn，或者由Thr突变为Cys的步骤。2.一种提高双功能纤维素酶对甘露聚糖底物的催化效率的方法，其特征在于，所述方法包括将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型的双功能纤维素酶的第100为氨基酸由Thr突变为Ile、Leu、Thr、Val或者Ser的步骤。3.一种催化效率提高的双功能纤维素酶突变体，其特征在于，所述纤维素酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO： 3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO： 7、SEQ ID NO： 9、SEQ ID NO： 11或SEQ ID NO. 13所示。4.一种纤维素酶基...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗会颖，郑洁，秦星，黄火清，王亚茹，柏映国，王苑，涂涛，苏小运，张杰，王晓璐，张红莲，于会民，杨浩萌，姚斌，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：