甘露聚糖酶混合物的制备方法及其在魔芋饮品中的应用技术

本发明专利技术提供了一种甘露聚糖酶混合物的制备方法及其在魔芋饮品中的应用，本发明专利技术利用基因工程的手段获得了两种不同水解特性的甘露聚糖酶基因，并将两种基因串联在毕赤酵母表达载体上，通过高密度发酵，获得水解能力强，水解后甘露寡糖2

【技术实现步骤摘要】
甘露聚糖酶混合物的制备方法及其在魔芋饮品中的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程及功能性食品制备领域，具体涉及一种甘露聚糖酶混合物的制备方法及其在魔芋饮品中的应用。

技术介绍

[0002]葡甘聚糖是一种可溶性半纤维素，是人体第七营养素纤维素中的优品。葡甘聚糖具有水溶、持水增稠、稳定、悬浮、胶凝、粘接、成膜等多种独特的理化性质而使它具有广泛的应用价值和开发价值。
[0003]葡甘聚糖是在普通的魔芋精粉的基础上进行加工提取而得的一种新产品，作为膳食纤维，不被吸收，不含有热量，有饱腹感，能减少和延缓葡萄糖的吸收，是糖尿病的良好辅助药物，可以预防肥胖和缓慢减肥，具有很好的食品保健功能，目前市面上已经有利用葡甘聚糖制备的功能食品和美妆产品。
[0004]甘露低聚糖是由2
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10个单糖分子通过糖苷键连接而成的低度聚合糖，是一种非消化性寡糖。大量研究发现其具有众多的生理活性作用：调节宿主肠道微生态环境，抑制有害菌并促进肠道微生物菌群的平衡，其促益生菌的效果高达低聚木糖的50～100倍；改善脂质、血糖代谢，降低血脂和胆固醇；促进微量元素及B维生素吸收等。具有不被人体降解、低甜度、不引发龋齿、不增加血糖浓度等特点，是新一代功能性食品。
[0005]近年来，关于低聚糖的研究越来越多，已有多种功能性低聚糖产品投入市场，但目前大多数低聚糖产品属于水解彻底的甘露低聚糖，经过复杂的提纯，过滤，脱色等一系列程序，获得的甘露寡糖作为保健品进行销售，价格相较于市面上其他的低聚糖较贵。葡甘聚糖和低聚糖，在肠道调节功能方面都具有很好的临床数据显示，但是葡甘聚糖和低聚糖在保健功能方面各有千秋。
[0006]本专利技术的目的是能做出一种不仅具有魔芋低聚糖的功能，又具有葡甘聚糖的功能，同时普通消费者也能消费得起的产品。那么如何寻找高活力的甘露聚糖酶，使水解的效率提高，并且使得水解后水解底物集中在10kD以下，并且能低成本地生产高纯度低聚糖，显得尤为重要。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供一种甘露聚糖酶混合物的制备方法及其在魔芋饮品中的应用；通过基因工程手段构建不同来源的甘露聚糖酶，构建串联重组的β
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甘露聚糖酶基因，构建不同来源的甘露聚糖酶同时表达的工程菌种，通过对工程菌种的高密度发酵，获得复合甘露聚糖酶水解高浓度甘露聚糖获得水解产物主要在2
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7糖的甘露寡糖，同时水解率达到90％以上。
[0008]本专利技术的技术方案是，一种甘露聚糖酶混合物，该甘露聚糖酶混合物中包括核苷酸序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
[0009]本专利技术还涉及所述甘露聚糖酶混合物的制备方法，包括以下步骤：
[0010]将来源于Aspergillus niger CBS 513.88的甘露聚糖酶去掉前段的20个氨基酸
的信号肽后的序列SEQ ID NO.1和来源于Humicola insolens Y1的甘露聚糖酶序列SEQ ID NO.2，利用DNAWORKS工具进行优化，优化后的基因全部由毕赤酵母偏爱密码组成；优化后的核苷酸序列更利于在毕赤酵母中表达。通过基因工程的手段，将具有不同水解功能，但是酶学性质兼容的两个基因装在同一个表达载体上，并将该基因整合到毕赤酵母基因组中，获得稳定表达甘露聚糖酶的工程菌种，通过甲醇诱导获得两种不同水解功能的甘露聚糖酶混合物。
[0011]进一步地，所述的表达载体为毕赤酵母表达载体pHBM905BDM，将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2分别融合在毕赤酵母表达载体上，得到质粒pHBM905BDM
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Man1和pHBM905BDM
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Man2。将重组质粒pHBM905BDM
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Man1，pHBM905BDM
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Man2电转毕赤酵母后，在甲醇诱导下高效分泌表达甘露聚糖酶。对两种甘露聚糖酶进行酶学性质分析，发现Man1的最适pH范围为pH5
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pH8，最适温度为40℃
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60℃，温度半衰期在10h以上；而Man2的最适pH范围为pH4.5
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pH11，最适温度为55℃
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80℃，温度半衰期在24h以上，金属离子对两个酶的酶活和敏感度都没有太大的影响。因此，非常适合在水溶液中将两种酶放在一起体系里面进行水解。
[0012]进一步地，利用限制性内切酶BamHⅠ、XbaⅠ双酶切pHBM905BDM
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Man1，获得含有基因序列SEQ ID NO.1的表达框；用SPeⅠ、BamHⅠ双酶切pHBM905BDM
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Man2，获得含有基因序列SEQ ID NO.2的载体骨架，根据SpeⅠ和XbaⅠ粘性末端能互补配对的原则，通过连接和转化操作，获得含序列SEQ ID NO.1和序列SEQ ID NO.2的两种基因的串联表达盒的重组质粒pHBM905BDM
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Man1
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Man2。
[0013]进一步地，工程菌种用BSM培养基，加入PTM1，10％接种量，首先30℃，300rpm，通气量1vvm，pH控制在4.5，培养12h后，补料50％浓度甘油，加入PTM1 24h，当OD600>200开始甲醇诱导加入PTM1，诱导温度为28℃，补料速度为5m/L/h，共诱导72h之后，获得甘露聚糖酶。
[0014]本专利技术还涉及所述的甘露聚糖酶混合物在魔芋粉或者瓜尔豆胶水解中的应用，水解底物浓度15％
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40％。
[0015]进一步地，水解时，添加底物和酶量比例为1g:10
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20μL。水解时均匀搅拌，无需调节pH，保持温度稳定50
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55℃。
[0016]本专利技术还涉及利用甘露聚糖酶混合物对魔芋粉或者瓜尔豆胶水解所得甘露寡糖在制备魔芋饮品中的应用。
[0017]进一步地，根据饮品的风味向饮品中加入海藻糖、人参提取物、燕窝、γ
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氨基丁酸、富氢水及其他辅料或食品添加剂。对不同品牌和不同价位的饮品选择不同的添加剂。
[0018]本专利技术具备以下有益效果：
[0019]本专利技术通过密码子优化的方法，获得了一种能水解魔芋甘露聚糖，得到分子量在10kd左右的寡糖的甘露聚糖酶，通过基因突变获得了一种能测定水解甘露聚糖，水解分子集中在2kd
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5kd左右的甘露低聚糖酶基因，将两种基因串联在毕赤酵母表达载体上，获得一种复合酶系，对魔芋精粉以及含有甘露聚糖的物质进行水解后，可以得到含有功能性寡糖和功能性葡甘聚糖的混合物，用该混合物制备固体饮料，省去了固定剂明胶的添加，同时具有了葡甘聚糖的保健功能和甘露寡糖的养生功能。
[0020]本专利技术得到的复合酶系，通过对单酶的酶学性质检测发现，两种酶在水解条件中有相兼容的条件，但是酶解功能不一样，一种酶水解的底物分子量较高，一种酶水解底物分子量较低，并将两种本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甘露聚糖酶混合物，其特征在于：该甘露聚糖酶混合物中包括核苷酸序列 SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。2.权利要求1所述甘露聚糖酶混合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将来源于Aspergillus niger CBS 513.88的甘露聚糖酶去掉前段的20个氨基酸的信号肽后的序列SEQ ID NO.1和来源于Humicola insolens Y1的甘露聚糖酶序列SEQ ID NO.2，利用DNAWORKS工具进行优化，优化后的基因全部由毕赤酵母偏爱密码组成；通过基因工程的手段，将具有不同水解功能，但是酶学性质兼容的两个基因装在同一个表达载体上，并将上述两个基因整合到毕赤酵母基因组中，获得稳定表达甘露聚糖酶的工程菌种，通过甲醇诱导获得两种不同水解功能的甘露聚糖酶混合物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的表达载体为毕赤酵母表达载体pHBM905BDM，将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2分别融合在毕赤酵母表达载体上，得到质粒pHBM905BDM
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Man1和pHBM905BDM
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Man2。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：利用限制性内切酶BamHⅠ、XbaⅠ双酶切pHBM905BDM
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Man1，获得含有基因序列SEQ ID NO.1的表达框；用SPeⅠ、BamHⅠ双酶切pHBM905BDM
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Man2，获得含有基因序列SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王亚平，余墨燚，余文杰，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：