本发明专利技术涉及植物细胞生物技术领域，特别是涉及一种从植物中提取真菌原生质体的组合物及其应用。所述组合物包括独立分装的组合物一和组合物二；所述组合物一包括纤维素酶和离析酶；所述纤维素酶的酶活为250～350U/g，所述离析酶的酶活为700～900U/g，所述纤维素酶和离析酶的质量比为(13.5～20.5):(3.5～4.5)；所述组合物二包括哈茨木霉裂解酶；所述哈茨木霉裂解酶的酶活为900～1000U/g。本发明专利技术通过适宜比例的纤维素酶和离析酶将被真菌侵染的植物原生质体从叶片中提取出来，再通过哈茨木霉裂解酶将侵染的真菌进行酶解，从而将真菌原生质体从植物叶片中提取出来，且提取的原生质体数量多，活性高。活性高。活性高。
【技术实现步骤摘要】
一种从植物中提取真菌原生质体的组合物及其应用
[0001]本专利技术涉及真菌原生质体
，特别是涉及一种从植物中提取真菌原生质体的组合物及其应用。
技术介绍
[0002]毛白杨是中国特有的乡土树种，分布广泛，在辽宁(南部)、河北、山东、山西、陕西等省均有分布，以黄河流域中、下游为中心分布区，在我国北方林业生产和生态环境建设中占有重要地位，是北方地区森林培育的先锋树种。但杨树为多年生树种，以传统的杂交育种方式进行遗传改良耗费时间较长。胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的杨树炭疽病是杨树的重要病害之一，病原菌主要侵染枝、叶，导致大片的杨树叶片枯死；炭疽菌(Colletotrichum)作为一种重要的模式病原真菌，在病原学、寄主与病原互作、侵染结构分化等研究方面具有重要的价值。目前，对于炭疽菌的原生质体的提取大多是采用对菌体进行酶解，酶解效果差，且无法将真菌原生质体从植物叶片中提取出来。
技术实现思路
[0003]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种从植物中提取真菌原生质体的组合物及其应用。本专利技术提供的组合物可以将真菌原生质体从植物叶片中提取出来，且提取的原生质体数量多，活性高。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种从植物中提取真菌原生质体的组合物，所述组合物包括独立分装的组合物一和组合物二；
[0006]所述组合物一包括纤维素酶和离析酶；所述纤维素酶的酶活为250～350U/g，所述离析酶的酶活为700～900U/g，所述纤维素酶和离析酶的质量比为(13.5～20.5):(3.5～4.5)；
[0007]所述组合物二包括哈茨木霉裂解酶；所述哈茨木霉裂解酶的酶活为900～1000U/g。
[0008]优选的，所述组合物一包括以下浓度的组分：纤维素酶13.5～20.5g/L、离析酶3.5～4.5g/L、乙磺酸15～20mmol/L、甘露醇0.57～0.6mol/L、KCl 15～20mmol/L、CaCl210～15mmol/L和牛血清蛋白0.8～1.1g/L。
[0009]优选的，所述纤维素酶包括纤维素酶R10，所述离析酶包括离析酶R10。
[0010]优选的，所述组合物二包括以下浓度的组分：哈茨木霉裂解酶18～22g/L和NaCl 0.7mol/L。
[0011]优选的，所述哈茨木霉裂解酶包括L1412
‑
10G裂解酶。
[0012]本专利技术还提供了上述组合物在提取真菌原生质体中的应用，所述应用包括从植物叶片中提取真菌原生质体。
[0013]本专利技术还提供了一种从植物叶片中提取真菌原生质体的方法，包括以下步骤：
[0014]1)将植物叶片与分离缓冲液混合离心，过滤，得第一沉淀物；所述分离缓冲液包括以下浓度的组分：MOPS 0.2mol/L、乙酸钠0.008mol/L、蔗糖0.2mol/L和EDTA 0.002mol/L；
[0015]2)将第一沉淀物与上述组合物中的组合物一混合，在黑暗条件下第一酶解4～5h，离心，得第二沉淀物，所述第一酶解的温度为26～30℃；
[0016]3)将步骤2)中的第二沉淀物与上述组合物中的组合物二混合，在黑暗条件下第二酶解4～6h，酶解液过滤得真菌原生质体溶液，所述第二酶解的温度为26～30℃。
[0017]优选的，步骤1)中所述的植物叶片在与分离缓冲液混合离心前还包括前处理；所述前处理包括：洗去叶片表面未萌发的孢子后将叶片进行切割处理。
[0018]优选的，步骤1)中所述的过滤的孔径为60～80μm。
[0019]优选的，步骤3)所述的过滤的孔径为22～25μm。
[0020]有益效果：
[0021]本专利技术提供了一种从植物中提取真菌原生质体的组合物，所述组合物包括独立分装的组合物一和组合物二；所述组合物一包括纤维素酶和离析酶；所述纤维素酶的酶活为250～350U/g，所述离析酶的酶活为700～900U/g，所述纤维素酶和离析酶的质量比为(13.5～20.5):(3.5～4.5)；所述组合物二包括哈茨木霉裂解酶；所述哈茨木霉裂解酶的酶活为900～1000U/g。本专利技术通过适宜比例的纤维素酶和离析酶将被真菌侵染的植物原生质体从叶片中提取出来，再通过哈茨木霉裂解酶将侵染的真菌进行酶解，从而将真菌原生质体从植物叶片中提取出来，且提取的原生质体数量多，活性高。
附图说明
[0022]图1为染菌的毛白杨叶片；
[0023]图2为毛白杨叶片剪成1～2mm的小细条图；
[0024]图3为实施例2制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片；
[0025]图4为实施例3制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片；
[0026]图5为对比例1制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片；
[0027]图6为对比例2制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片；
[0028]图7为对比例3制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片；
[0029]图8为对比例4制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片；
[0030]图9为对比例5制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片。
具体实施方式
[0031]本专利技术提供了一种从植物中提取真菌原生质体的组合物，所述组合物包括独立分装的组合物一和组合物二；
[0032]所述组合物一包括纤维素酶和离析酶；所述纤维素酶的酶活为250～350U/g，所述离析酶的酶活为700～900U/g，所述纤维素酶和离析酶的质量比为(13.5～20.5):(3.5～4.5)；
[0033]所述组合物二包括哈茨木霉裂解酶；所述哈茨木霉裂解酶的酶活为900～1000U/g。
[0034]在本专利技术中，所述植物优选包括毛白杨；本专利技术从所述毛白杨中提取真菌的原生
质体，所述真菌优选包括炭疽菌，更优选包括胶孢炭疽菌。
[0035]在本专利技术中，所述组合物一优选包括以下浓度的组分：纤维素酶13.5～20.5g/L、离析酶3.5～4.5g/L、乙磺酸15～20mmol/L、甘露醇0.57～0.6mol/L、KCl 15～20mmol/L、CaCl210～15mmol/L和牛血清蛋白0.8～1.1g/L，更优选为纤维素酶20g/L、离析酶4g/L、乙磺酸20mmol/L、甘露醇0.6mol/L、KCl 20mmol/L、CaCl210mmol/L和牛血清蛋白1g/L；所述纤维素酶包括纤维素酶R10，所述离析酶包括离析酶R10；所述乙磺酸优选包括吗啉乙磺酸(MES)。本专利技术对上述各组分的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。本专利技术通过适宜比例的纤维素酶和离析酶组合使用对植物叶片组织进行酶解，不仅保持了植物原生质体的高活性，且获得的植物原生质体的数量多；再通过添加适宜比例的果胶酶进一步提高了植物原生质体的数量，从而提高了侵染植物的真菌的原生质体数量。...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种从植物中提取真菌原生质体的组合物，其特征在于，所述组合物包括独立分装的组合物一和组合物二；所述组合物一包括纤维素酶和离析酶；所述纤维素酶的酶活为250～350U/g，所述离析酶的酶活为700～900U/g，所述纤维素酶和离析酶的质量比为(13.5～20.5):(3.5～4.5)；所述组合物二包括哈茨木霉裂解酶；所述哈茨木霉裂解酶的酶活为900～1000U/g。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物一包括以下浓度的组分：纤维素酶13.5～20.5g/L、离析酶3.5～4.5g/L、乙磺酸15～20mmol/L、甘露醇0.57～0.6mol/L、KCl 15～20mmol/L、CaCl
2 10～15mmol/L和牛血清蛋白0.8～1.1g/L。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述纤维素酶包括纤维素酶R10，所述离析酶包括离析酶R10。4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物二包括以下浓度的组分：哈茨木霉裂解酶18～22g/L和NaCl 0.7mol/L。5.根据权利要求1或4所述的组合物，其特征在于，所述哈茨木霉裂解酶包括L1412
‑
10G裂解酶。6.权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢剑波，谭书贤，刘思佳，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。