一种检测高盐高蛋白质生物样品中多聚核苷酸激酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种寡核苷酸序列稳定的银纳米团簇（ssDNA/AgNCs）用于高盐、高蛋白质等复杂生物基质样品中T4多聚合核苷酸激酶（T

【技术实现步骤摘要】
一种检测高盐高蛋白质生物样品中多聚核苷酸激酶的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域的基因工程工具酶和荧光纳米材料ssDNA/AgNCs，公开了一种ssDNA/AgNCs用于高盐高蛋白复杂生物基质样品中T4多聚合核苷酸激酶（T
4 PNK）活性检测的新方法，拓展了ssDNA/AgNCs在复杂样品中检测的应用。

技术介绍

[0002]基因工程的工具酶是应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取重组体 DNA 制备等程序中所需要的酶类。基因工程常用的工具酶，主要是核酸酶、聚合酶、连接酶、DNAzyme和其他修饰酶等。本实验着重介绍四种基因工程工具酶，分别是T
4 PNK酶、T
4 DNA 连接酶、Vent
® (exo
‑
) DNA酶和 Nt.BstNBI酶。T
4 PNK来自携带克隆的 T
4 PNK 基因的大肠杆菌菌株，催化 Pi 从 ATP 的 γ 位置转移和交换到多核苷酸和核苷 3'
‑
单磷酸的 5'
‑
羟基末端(5
’‑
OH)，进而 T
4 DNA 连接酶将催化5'
‑
磷酸末端(5
’‑
PO4)和3
’‑
羟基末端(3
’‑
OH)形成磷酸二酯键从而连接两个DNA片段。Nt.BstNBI是一个缺口内切酶，它识别 DNA 双链体的不对称序列 5
’‑
GAGTC
‑3’
，并且在距离 3
’
末端四个碱基处仅切割一条链，可以与 Vent
® (exo
‑
) DNA聚合酶于55℃协同反应，因此 Nt.BstNBI 有助于循环放大检测信号，实现对目标物的低浓度检测。
[0003]银纳米簇（AgNCs）是由几个到几十个银原子组成，它们的超小尺寸接近电子的费米波长，从而其连续的能带被分离成多个独立的能级，展示出分子特性如强荧光性，解决了传统荧光染料光漂白的问题，可作为一种稳定的可控荧光信号源用于生物分子检测。其中，以ssDNA为模板合成的银纳米簇制备简单，往往具有较高的荧光量子产率、光稳定性、发射波长依赖于DNA序列和良好的生物相容性等优点。ssDNA/AgNCs的荧光变化有两种类型。一种是靠近富鸟嘌呤(G)的DNA序列，导致AgNCs的荧光显著增强，而另一种是ssDNA/AgNCs与其互补寡核苷酸杂交，导致AgNCs荧光发生变化。基于不同的荧光“开启”和“关闭”模型，ssDNA/Ag NCs 已成功应用于检测各种生物学上重要的分析物。尽管有这些有利因素，目前基于 ssDNA/Ag NCs 的荧光传感器仍然存在高背景、抗干扰能力弱和相对较低的灵敏度。为提高抗干扰能力，测定样品前进行高倍数稀释尤为重要，但这使得操作变得复杂，灵敏度同样受到挑战。此外，为解决ssDNA/Ag NCs灵敏度低的问题，采用相应扩增方式富集DNA尤为重要。迄今为止，扩增时常用的基因工程工具酶仅限于Exonuclease III (E. coli)，限制了ssDNA/Ag NCs在分子生物学领域的应用。
[0004]DNA 5'
‑
羟基末端的磷酸化对于细胞事件很重要，例如 DNA 复制、重组和修复由一些内源性或外源性因素（包括化学物质、电离辐射以及核酸酶等）引起的 DNA 损伤。5'
‑
羟基末端的磷酸化通常由各种修复酶催化，包括常用的T
4 PNK。T
4 PNK 最初是在感染了 T
‑
even 噬菌体的大肠杆菌的蛋白质提取物中发现的。自 50 多年前发现以来，T
4 PNK 已成为双功能修复酶家族的典范，并已成为分子生物学的主力军以及生物学和生物工程领域的宝贵研究工具。其 5'
‑
激酶活性允许 T
4 PNK 磷酸化 DNA/RNA 分子的 5'
‑
羟基末端。这将 DNA/RNA 转化为 DNA/RNA 连接酶所需的 5'
‑
磷酸底物，在 DNA 和 RNA 修复中发挥重要
作用。由于 T
4 PNK 具有这些重要的生物学作用，因此准确监测其活性是非常必要的。有许多针对 T
4 PNK 的检测方法，包括生物发光、电化学和荧光等方法。尽管它们的性能良好，但其中一些方法操作复杂，不能实现检测复杂样品。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供寡核苷酸序列稳定的银纳米团簇（ssDNA/AgNCs）用于高盐、高蛋白质复杂生物基质样品中 T
4 多聚合核苷酸激酶（T
4 PNK）活性检测的新方法。
[0006]本专利技术另一目的在于以定量检测 Hela 细胞抽提物、人血清和尿液中 T
4 PNK 为例，提供上述寡核苷酸序列稳定的银纳米团簇（ssDNA/AgNCs）用于高盐高蛋白复杂生物基质样品中 T
4 多聚合核苷酸激酶（T4 PNK）活性检测的具体构筑方式。
[0007]本专利技术的目的通过下述方案实现：一种用于高盐、高蛋白质复杂生物基质样品中 T
4 多聚合核苷酸激酶（T
4 PNK）活性检测的寡核苷酸序列，其特征在于它包括五条DNA链；DNA链分别是 T2‑
DNA链、L
‑
DNA链、T1‑
DNA链、ssDNA 链和Target
‑
DNA；其中，T2‑
DNA链、T1‑
DNA链均与 L
‑
DNA链互补；ssDNA为暗态银簇模板链；Target
‑
DNA由两部分组成，3
’
端含有富G序列，5
’
端与银簇模板链 ssDNA 部分互补，同时也与L
‑
DNA 链互补，并且与ssDNA互补的碱基个数小于与L
‑
DNA互补碱基个数；传感中使用的 T2‑
DNA、L
‑
DNA、T1‑
DNA、ssDNA 和 Target
‑
DNA序列如下所示：T2‑
DNA(SEQ ID NO.1)：TAGGCAGGAG；L
‑
DNA(SEQ ID NO.2)：CCCCACCCCACCCCACCCGCCACATGTTATTCCAAAATTAGACTCCTCCTGCCTACGCCACCACCT；T1‑
DNA(SEQ ID NO.3)：GAGGTGGTGG；ssDNA (SEQ ID NO.4)：CCCTTAATCCCCGCCACATGTTATTCCAAA；Target
‑
DNA(SEQ ID NO.5):TTTGGAATAACATGTGGCGGGTGGGGTGGGGTGGGG。
[0008]本专利技术进一步公开了采用所述寡核苷酸序列用于高盐、高蛋白质的复杂生物基质样品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于高盐、高蛋白质复杂生物基质样品中 T
4 多聚合核苷酸激酶（T
4 PNK）活性检测的寡核苷酸序列，其特征在于它包括五条DNA链；DNA链分别是 T2‑
DNA链、L
‑
DNA链、T1‑
DNA链、ssDNA 链和Target
‑
DNA链；其中，T2‑
DNA链、T1‑
DNA链均与 L
‑
DNA链互补；ssDNA为暗态银簇模板链；Target
‑
DNA由两部分组成，3
’
端含有富G序列，5
’
端与银簇模板链 ssDNA 部分互补，同时也与L
‑
DNA 链互补，并且与ssDNA互补的碱基个数小于与L
‑
DNA互补碱基个数；传感中使用的 T2‑
DNA、L
‑
DNA、T1‑
DNA、ssDNA 和 Target
‑
DNA序列如下所示：T2‑
DNA：TAGGCAGGAG；SEQ ID NO.1L
‑
DNA：CCCCACCCCACCCCACCCGCCACATGTTATTCCAAAATTAGACTCCTCCTGCCTACGCCACCACCT；SEQ ID NO.2T1‑
DNA：GAGGTGGTGG；SEQ ID NO.3ssDNA：CCCTTAATCCCCGCCACATGTTATTCCAAA；SEQ ID NO.4Target
‑
DNA:TTTGGAATAACATGTGGCGGGTGGGGTGGGGTGGGG；SEQ ID NO.5。2.采用权利1要求所述寡核苷酸序列用于高盐、高蛋白质的复杂生物基质样品中 T
4 多聚合核苷酸激酶（T
4 PNK）活性检测的寡核苷酸序列的方法，其特征在于按下述步骤进行：（1）以单链T2‑
DNA为起点；首先，T
4 PNK存在时，催化磷酸基团(Pi) 从三磷酸腺苷(ATP)的 γ 位置转移和交换到单链 T2‑
DNA 的 5'
‑
OH末端，实现5'
‑
OH末端到5'
‑
PO4末端的转换，便于后续T2‑
DNA与T1‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘越，姚美荣，李琰，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：