具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法技术

本发明专利技术涉及具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法，将MSLN

【技术实现步骤摘要】
具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法。

技术介绍

[0002]癌症作为严重威胁人类健康的疾病之一，不仅对患者身心造成了危害，而且还给家庭、社会和国家带来了巨大的经济负担。目前临床上恶性肿瘤的常见治疗手段包括手术、放化疗以及靶向治疗等，但这类治疗不能有效的控制一些恶性肿瘤的进展及复发，也不能有效的延长此类患者的生存期及改善患者的生存质量。因此迫切需要寻求新的治疗手段。
[0003]近年来免疫治疗成为一种重要的肿瘤治疗手段，给攻克恶性肿瘤带来了希望。研究表明大多数的肿瘤细胞能够躲避免疫系统的识别，从而限制免疫治疗的抗癌效果。
[0004]嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor T，CAR
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T）细胞治疗技术具有良好的靶向性、杀伤性、增殖性及持久性而成为肿瘤免疫治疗的热点。虽然大量的临床研究证实该技术在改善血液恶性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：将MSLN
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CAR
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puro质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上涂布筛选培养，长出的单菌落扩大繁殖后提取质粒；步骤二：利用密度梯度离心法制备人外周血单核淋巴细胞PBMC；步骤三：将步骤一提取的质粒、Super PiggyBac Transposase质粒与电转缓冲液混合，制得电转混合液，并用电转混合液转染PBMC细胞，得到转染后的PBMC细胞；步骤四：将转染后的PBMC细胞使用X
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VIVO培养基进行培养，用CD3/CD28磁珠激活扩增CD3阳性T细胞，用1μg/mL嘌呤霉素筛选并培养扩增转染后的T细胞，获得Mesothelin嵌合抗原受体修饰的T细胞MSLN
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CAR
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T。2.根据权利要求1所述的具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法，其特征在于，步骤一中，将MSLN
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CAR
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puro质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上涂布筛选培养，长出的单菌落扩大繁殖的具体方法为：（1.1）将大肠杆菌感受态细胞DH5α从
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80℃下取出并放置于冰上孵育5min，待其融化；（1.2）将1μL MSLN
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CAR
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puro质粒加入到装有100μl大肠杆菌感受态细胞DH5α的1.5mL EP管中，混匀后放置于冰上孵育30分钟，之后于42℃下热激90秒后，再放置于冰上孵育2分钟；接着加入37℃预热的700μl无氨苄青霉素的LB液体培养基，混匀后放置于37℃摇床；待培养基变浑浊，则取出2
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3μl摇匀的菌液加入到37℃的LB固体培养基中，再加入3
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5粒灭菌涂布珠摇匀；再将固体培养基倒置，于37℃下培养10
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12小时，孵化菌群；（1.3）挑取单菌落加入预热好的5mL含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中；于37℃摇床培养，待培养基变浑浊之后，将摇好的菌液全部加入200mL含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃摇床培养；将培养好的菌液取1
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5mL保存菌种后，剩下的菌液进行质粒提取。3.根据权利要求2所述的具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法，其特征在于，（1.2）中，摇床速度为255转/min，时间为45分钟；（1.3）中，第一次摇床速度为255转/min，时间为3小时；第二次摇床速度为每分钟255转/min，时间为12
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24小时；以上摇床均在37摄氏度下工作。4.根据权利要求1所述的具有靶向高强度杀瘤活性的Mesothelin嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法，其特征在于，步骤三的具体方法为：（3.1）将步骤二制得的人外周血单核淋巴细胞PBMC用X
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VIVO培养基重悬，调整密度为1
×
106/mL，放于37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，之后根据每个反应20
×
106细胞量分装后离心，弃上清，用PBS重悬后收集至E...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭晶，李汝红，王文举，黄文文，段德仁，林杼颖，侯宗柳，孟明耀，李琳，
申请(专利权)人：昆明市延安医院，
类型：发明
国别省市：