本发明专利技术公开了一种白术内生真菌、发酵产物及其应用，该内生真菌是从菊科苍术属植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，于2021年4月9日保藏于保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类命名为拟茎点霉菌AM569(Phomopsis sp.)，菌种保藏编号为CGMCC No.21947，发酵产物是通过PDB液体培养基发酵提纯得到。本发明专利技术同时发明专利技术公开了发酵产物的用途：AM569的液体发酵产物能抑制白术根腐病病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和半裸镰刀菌(Fusarium incarnatum)的生长，抑菌率均为100％，达到了完全抑制的效果，同时能显著增强白术对根腐病的抗性，降低白术病情指数82.16％。本发明专利技术的发酵产物对白术根腐病具有较好的防治作用，为白术根茎类病害的生物防治领域带来了广阔的应用前景。领域带来了广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种白术内生真菌、发酵产物及其应用
[0001]本专利技术涉及植物病害防控
，具体地说，是一种白术内生真菌及其发酵产物在抑制白术根腐病病原菌生长和/或增强白术对根腐病的抗性中的应用。
技术介绍
[0002]中药白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，始载于《神农本草经》，被列为上品，性温，味甘，入脾、胃经，具健脾益气，燥湿利水，止汗安胎等功效，用于脾虚食少，痰饮眩悸，腹胀泄泻，水肿，自汗，胎动不安等症。现代药理研究表明，白术具有保肝，调节胃肠运动、调节便秘、调节溃疡性急肠炎、调节免疫功能、调节脂代谢，抗炎抗肿瘤，降血糖等作用。
[0003]根腐病是白术栽培生产中最主要的土传性病害之一，危害严重，是白术生产种植链中亟待解决的问题。白术根腐病病原菌为复合性病原菌，主要为镰刀菌属真菌，包括尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum)、半裸镰刀菌(Fusarium incarnatum)等。目前，在栽培管理中白术根腐病主要依靠化学农药防治，易导致环境污染、农药残留以及产生抗药性等问题。
[0004]内生真菌是指生活史的某一个阶段能侵染定殖在健康植物组织内部，并且不会引起宿主植物明显病症的一类真菌。研究表明，几乎所有的植物体内都存在着植物内生真菌，植物内生真菌与宿主植物协同进化，互惠共生。植物内生真菌往往对植物病原菌具有一定拮抗作用，如有学者研究发现苦参内生真菌BS001(Aspergillu terreus)菌株对产气肠细菌和黄瓜枯萎病菌具有显著的抑菌效果，BS001菌株发酵液中的抗菌活性物质能抑制黄瓜枯萎病菌丝的生长，同时抑制孢子萌发，对黄瓜枯萎病病原菌合成梭甲基纤维素酶有抑制作用，并且可以使细胞膜结构受损，从而能很好的抑制黄瓜枯萎病。从丹参中分离筛选得到的拟茎点霉属真菌Phomopsis sp.S4，其发酵液提取物对稻瘟病菌丝的细胞壁造成了破坏，从而干扰了菌丝正常的生理功能，进而抑制了稻瘟病菌的生长。因此，植物内生真菌发酵产物是植物病害防控
重要资源。
[0005]但是，关于白术内生真菌发酵产物抑制白术根腐病病原菌生长和/或增强白术对根腐病的抗性作用目前鲜有报道。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种白术内生真菌、发酵产物及其在抑制白术根腐病病原菌生长和/或增强白术对根腐病的抗性中的应用。
[0007]本专利技术的第一方面，提供了一种植物内生真菌，所述内生真菌是从菊科苍术属植物白术 Atractylodes macrocephala Koidz.活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，命名为拟茎点霉菌AM569(Phomopsis sp.)。该菌株已保藏，菌株保藏号为CGMCC No.21947，保藏日期为2021年4月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。
[0008]本专利技术所述的内生真菌的固体培养特征为：
[0009]在土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)上26℃黑暗培养，菌株生长速度较快，菌落呈灰白色，菌体短绒毛状，中心白色菌丝稍多，绒毛状明显，外圈菌丝多灰色，贴板生长，菌丝直径2.1～6.5 μm，菌丝有明显分隔。
[0010]本专利技术所述的内生真菌的ITS扩增碱基序列如SEQ ID NO.1所示，将测序结果于NCBI 网站进行序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，同Phomopsis asparagi(KX866925) 与Phomopsis eucommii(AY601921)同源性均达99％。用MEGA 7.0软件做序列比对，用邻接法(Neighbor
‑
joining，NJ)分析，随机挑选1个序列，重复比对1000次。本专利技术所述内生真菌的系统进化树见图3。
[0011]本专利技术所述的内生真菌发酵产物首先是在PDA固体培养基上进行AM569菌株活化，然后打取5mm菌饼放入PDB液体培养基中于摇床中黑暗培养，8d后收集菌丝与发酵滤液，分别用甲醇与乙酸乙酯提取(萃取)，旋蒸至浸膏状，甲醇与DMSO溶解所得，如图4所示。固体培养基(PDA)的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000mL蒸馏水，15g琼脂，pH 自然。液体培养基(PDB)的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000mL蒸馏水，pH自然。
[0012]本专利技术的第二方面，提供了上述内生真菌发酵产物在抑制白术根腐病病原菌生长和/或增强白术对根腐病的抗性中的应用。
[0013]所述的上述应用，内生真菌AM569发酵产物能抑制白术根腐病病原菌尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum)和半裸镰刀菌(Fusarium incarnatum)的生长。
[0014]上述应用，主要通过以下技术方案来实现的：(1)取上述的内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的土豆葡萄糖培养基(配方为土豆200g，葡萄糖 20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然)，26℃，65％湿度条件下暗培养7d；(2)无菌条件下，用5mm的打孔器打取上述菌株菌落边缘的菌块，转接于含有50mL的PDB培养基中，在26℃、180r/min恒温条件下摇床震荡培养8d；(3)将发酵产物抽滤得到发酵滤液与菌丝，将菌丝烘干(50℃)称量后，粉碎菌丝制成粉末，以甲醇(mL)：菌丝(g)＝20：1 的比例超声提取1h，抽滤得菌丝提取液；(4)将发酵滤液以乙酸乙酯：菌液＝1：1的比例萃取三次，蒸干，将菌丝提取液与萃取蒸发后的发酵滤液混合，适量甲醇超声溶解，旋蒸至浸膏状，加入适量DMSO溶液，用甲醇定容至10mL，即得内生真菌发酵产物；(5)采用添加发酵产物至培养基的方式，对生长在PDA平板上的病原菌进行抑制培养，浓度为10mg/mL，培养周期为7d，能有效抑制白术根腐病病原菌的生长，如图5所示；(6)采用灌根的方式施用AM569发酵产物，浓度为0.01mg/mL，施用量为2mL/次/d，持续7d，能降低白术根腐病病情指数82.16％，如图6所示。
[0015]本专利技术优点在于：
[0016]本专利技术所述的内生真菌拟茎点霉菌AM569，通过液体培养基制备的发酵产物，能有效抑制白术根腐病病原的生长，增强白术对根腐病的抗性。拟茎点霉菌AM569对白术根腐病的生物防治作用在农业领域内的推广具有巨大的价值。
附图说明
[0017]图1：拟茎点霉菌AM569(Phomopsis sp.)在PDA固体培养基上的菌落形态；
[0018]图2：拟茎点霉菌AM569(Phomopsis sp.)在光学显微镜下的菌丝形态(10
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40)；
[0019]图3：基于ITS4和ITS5引物扩增的AM569(Phomopsis sp.)系统进化树(NJ法)；
[0020]图4：拟茎点霉菌AM569(Phom本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种白术内生真菌，其特征在于，所述的内生真菌是从菊科苍术属植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，于2021年4月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类命名为拟茎点霉菌AM569(Phomopsis sp.)，菌种保藏编号为CGMCC No.21947。2.一种权利要求1所述白术内生真菌的发酵产物，其特征在于，所述发酵产物是通过PDB液体培养基发酵提纯得到，PDB培养基的配方是：土豆(200g)，葡萄糖(20g)，蒸馏水(1000mL)，pH自然。3.一种权利要求2所述发酵产物具体按照以下步骤制备获得：(1)挑取AM569菌株单菌落接种于PDB液体培养基中，恒温条件下摇床震荡培养8d；(2)将发酵产物抽滤得到发酵滤液与菌丝，将菌丝烘干称量后，粉碎菌丝制成粉末，以甲醇(mL)：菌丝(g)＝20：1的比例超声提取，抽滤得菌丝提取液；(3)将发酵滤液以乙酸乙酯：菌液＝1：1的比例萃取多次，蒸干，将菌丝提取液与萃取蒸发后的发酵滤液混合，加入...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱波，秦路平，何玟叶，张轲杰，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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