一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法，包括：步骤一，通过基因测序获得生物信息，设计合成肿瘤新生抗原多肽；步骤二，将肿瘤新生抗原多肽负载到未成熟DC细胞，利用细胞因子诱导DC细胞成熟；步骤三，将成熟的DC细胞与初始T细胞进行多轮共孵育刺激；步骤四，利用免疫磁珠技术分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞；步骤五，扩增得到纯度高且具有杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞；步骤六，冻存得到肿瘤新生抗原特异性T细胞；通过本发明专利技术的方法能够大量且高效的制备出纯度高且具有高杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞，肿瘤杀伤效率接近100％；成本低，速度快，满足市场需求。满足市场需求。满足市场需求。

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法


[0001]本专利技术涉及细胞生物
，特别是一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法。

技术介绍

[0002]近来，由于过继性免疫细胞治疗在治疗恶性黑色素瘤和血液系统的肿瘤中取得了突破性进展；其再次成为肿瘤免疫治疗研究领域的热点。目前国际上常见的过继性免疫细胞治疗的效应细胞主要包括肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte，缩写TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(Dendritic Cell
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Cytokine Induced Killer，缩写DC
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CIK)、嵌合抗原受体修饰的T细胞(Chimeric Antigen Receptor T
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Cell，缩写CAR
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T)和T细胞受体基因工程改造的T细胞(T
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Cell Receptor gene engineered T
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cell,缩写TCR
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T)。对于过继性免疫细胞治疗来说，高特异性的肿瘤抗原靶点的获得极为关键，其常见方法有：直接利用肿瘤组织分解物、提取肿瘤细胞的裂解物、或根据肿瘤类型筛选已知的高表达肿瘤相关抗原(Tumor Associate Antigen，缩写TAA)进行制备获得。目前TIL和DC
‑
CIK疗法多采用前两种方法制备得到肿瘤抗原，其特异性较差，因此存在大量效应细胞未能特异性识别肿瘤细胞，疗效有限。而CAR
‑/>T和TCR
‑
T多采用TAA作为靶点。由于TAA并非肿瘤细胞所特有，在部分正常细胞中也有一定量的表达，所以TAA的肿瘤特异性不高，靶向TAA的疗法易产生脱靶毒副作用，基于TAA的杀伤性T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤功效并不明显。目前，CAR
‑
T和TCR
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T疗法仅在血液肿瘤的治疗中显示出有效性，其对实体瘤的治疗效果仍十分有限，因此还未大规模在临床推广应用。
[0003]最近研究显示，癌细胞由于基因变异而产生的带有肿瘤特异性的氨基酸序列被称为“肿瘤新生抗原”(neoantigen)。这些蛋白是癌细胞在发生以及发展过程中产生的，会被表达到肿瘤细胞表面。理论上可以利用这类肿瘤新生抗原训练免疫细胞特异性识别肿瘤细胞，激活免疫系统，对癌细胞进行特异性地高效杀伤。为了克服现有技术的限制，需要开发一种制备肿瘤新生抗原特异性T细胞的通用技术。
[0004]目前常用的扩增特异性T细胞的方法主要是利用单核细胞(monocyte)(包括未成熟DC细胞)贴壁生长的特性将未成熟DC细胞与T细胞分离。从患者外周血中分离单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，缩写PBMC)后，将其加入适量培养基后在培养箱中孵育2h，其中所有贴壁细胞被认为是未成熟DC细胞，悬浮细胞被认为是T细胞；将悬浮细胞通过收集洗涤后作为T细胞保存；将抗原与贴壁细胞(未成熟DC细胞)共孵育，并通过多种细胞因子诱导贴壁细胞，使未成熟DC细胞成熟；然后再将得到的细胞与之前收集的悬浮细胞共培养，利用白介素2(IL
‑
2)联合CD3抗体刺激T细胞分裂增殖。此方法获得的未成熟DC细胞由于含有T细胞而造成纯度低；直接导致通过诱导未成熟DC细胞得到的成熟DC细胞的纯度低、数量少；最终在共培养的细胞悬液中获得的肿瘤新生抗原特异性T细胞的比例极低，对肿瘤细胞的杀伤效果十分有限。
[0005]因此，亟需专利技术一种能够大量且高效地制备出纯度高且具有高杀伤活性、高质量
的肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法，以满足临床患者的治疗需求。

技术实现思路

[0006]为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种能够大量且高效地制备出纯度高且具有高杀伤活性、高质量的肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法，以满足临床治疗的需求。
[0007]为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：
[0008]一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法，包括：
[0009]步骤一，合成肿瘤新生抗原多肽；
[0010]步骤二，将肿瘤新生抗原多肽负载到未成熟DC细胞，对未成熟DC细胞进行诱导，获得负载有肿瘤新生抗原的成熟DC细胞；
[0011]步骤三，将成熟DC细胞与纯化后的初始T细胞进行1～3轮的共刺激培养，从而获得含有表面被标记的肿瘤新生抗原特异性T细胞的细胞悬液；
[0012]步骤四，从细胞悬液中分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞；
[0013]步骤五，对肿瘤新生抗原特异性T细胞进行扩增处理，得到具有杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞。
[0014]前述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法，步骤一，合成肿瘤新生抗原多肽；
[0015]具体方法包括：
[0016]步骤1.1，根据肿瘤组织的全外显子与转录组测序数据分析得到体细胞突变位点，预测肿瘤新生抗原短多肽序列；
[0017]步骤1.2，根据短多肽序列的起始和终止位置关系及组合方式设计出若干条对应的长多肽序列，长多肽序列包含15～30个氨基酸；
[0018]步骤1.3，对长多肽序列进行筛选；
[0019]步骤1.4，根据筛选得到的长多肽序列合成长度为15～30个氨基酸的长多肽。
[0020]前述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法，步骤二中对未成熟DC细胞进行诱导的具体方法包括：利用细胞因子对未成熟DC细胞进行诱导；细胞因子包括如下细胞因子至少一个：α4
‑
1BB
×
CD40L双特异性抗体、OX40、TLR
‑
3、TLR
‑
6、TLR
‑
7/8、TLR
‑
9。
[0021]前述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法，细胞因子为：500～1000U/ml TNF
‑
α、5～10ng/ml IL
‑
6、5～10ng/ml IL
‑
1β、0.5～2μg/ml PGE
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2、0.5～2μg/mlα4
‑
1BB
×
CD40L双特异性抗体、0.5～2μg/ml OX40、0.5～2μg/ml TLR
‑
3、0.5～2μg/ml TLR
‑
6、0.5～2μg/ml TLR
‑
7/8、0.5～2μg/ml TLR
‑
9。
[0022]前述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法，步骤三中纯化后的初始T细胞是指通过免疫磁珠纯化获取的初始T细胞；免疫磁珠纯化的方法包括但不仅限于：CD45RA MicroBeads免疫磁珠纯化方法、Naive Pan T Cell Isolation Kit免疫磁珠纯化方法。
[0023]前述的一种肿瘤新生抗原特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法，其特征在于，包括：步骤一，合成肿瘤新生抗原多肽；步骤二，将肿瘤新生抗原多肽负载到未成熟DC细胞，对未成熟DC细胞进行诱导，获得负载有肿瘤新生抗原的成熟DC细胞；步骤三，将成熟DC细胞与纯化后的初始T细胞进行1～3轮的共刺激培养，从而获得含有表面被标记的肿瘤新生抗原特异性T细胞的细胞悬液；步骤四，从细胞悬液中分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞；步骤五，对肿瘤新生抗原特异性T细胞进行扩增处理，得到具有杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞。2.根据权利要求1所述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法，其特征在于，步骤一，合成肿瘤新生抗原多肽；具体方法包括：步骤1.1，根据肿瘤组织的全外显子与转录组测序数据分析得到体细胞突变位点，预测肿瘤新生抗原短多肽序列；步骤1.2，根据短多肽序列的起始和终止位置关系及组合方式设计出若干条对应的长多肽序列，所述长多肽序列包含15～30个氨基酸；步骤1.3，对长多肽序列进行筛选；步骤1.4，根据筛选得到的长多肽序列合成长度为15～30个氨基酸的长多肽。3.根据权利要求1所述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法，其特征在于，步骤二中所述对未成熟DC细胞进行诱导的具体方法包括：利用细胞因子对未成熟DC细胞进行诱导；所述细胞因子包括如下细胞因子至少一个：α4
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1BB
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CD40L双特异性抗体、OX40、TLR
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3、TLR
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6、TLR
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7/8、TLR
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9。4.根据权利要求3所述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞因子为：500～1000U/ml TNF
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α、5～10ng/ml IL
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6、5～10ng/ml IL
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1β、0.5～2μg/ml PGE
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2、0.5～2μg/mlα4
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1BB
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CD40L双特异性抗体、0.5～2μg/ml OX40、0.5～2μg/ml TLR
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3、0.5～2μg/ml TLR
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6、0.5～2μg/ml TLR
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7/8、0.5～2μg/ml TLR
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9。5.根据权利要求1所述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤三中纯化后的初始T细胞是指通过免疫磁珠纯化获取的初始T细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫凡，刘亮，丁冬，
申请(专利权)人：杭州纽安津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：