特异性识别6制造技术

本发明专利技术利用链霉亲和素修饰的磁珠

【技术实现步骤摘要】
特异性识别6
′‑
唾液酸乳糖的ssDNA适配体及其筛选方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域，尤其涉及一种特异性识别6
′‑
唾液酸乳糖的ssDNA适配体及其筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]唾液酸乳糖是一种人乳寡糖(HMOs)，作为益生元，在促进婴儿大脑发育、提高婴儿免疫力等方面发挥着重要作用。6
′‑
唾液酸乳糖和3
′‑
唾液酸乳糖是唾液酸乳糖的主要形式，两者都具有抗菌活性和免疫调节作用。6
′‑
唾液酸乳糖含量是婴幼儿配方奶粉中重要的营养指标。至今为止，高效液相色谱法、高pH阴离子交换色谱法、质子核磁共振光谱法和质谱法已被广泛应用于6
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唾液酸乳糖的定性和定量检测。然而，虽然这些方法目前在食品和生物医学领域得到了广泛的应用，但耗时长，成本高，对检验员的技术要求高等缺点却限制了应用。因此，需要开发一种快速检测唾液酸乳糖的方法以满足市场需求，而高特异性的识别元件又是构建检测方法的基础。
[0003]目前，用于构建糖生物传感器的生物识别元件主要有凝集素、抗体、合成分子印迹聚合物和硼酸盐等。然而，由于糖的复杂性，上述生物识别元件在生物传感器的构建和应用中受到限制。例如，凝集素只能识别特定类型的糖，不能对糖进行进一步的差异分析；抗体制备成本高，限制了其在糖检测中的应用；合成的分子印迹聚合物与硼酸盐的亲和性和特异性较差。因此，有必要开发一种新的生物识别元件来构建糖生物传感器。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术公开了一种特异性识别6
′‑
唾液酸乳糖的ssDNA适配体，并进一步基于适配体构建了一种荧光生物传感器，该荧光生物传感器可用于6
′‑
唾液酸乳糖的检测，有较优的灵敏度及准确度。
[0005]本专利技术公开了一种特异性识别6
′‑
唾液酸乳糖的ssDNA适配体，核苷酸序列为SEQ ID NO.1
‑
4所示序列之一，具体的，SEQ ID NO.1
‑
4的序列为：
[0006]Apt 3(SEQ ID NO.1)：
[0007]5′‑
TAGGGAATTCGTCGACGGATGCCGTGGCGTCTGCAACGGAAAAGAATTTATCTTGTCCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG
‑3′
；
[0008]Apt 8(SEQ ID NO.2)：
[0009]5′‑
TAGGGAATTCGTCGACGGATCCATCCCCACGACGGTCAAGGCCGCGTGCCGGTAGGGCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG
‑3′
；
[0010]Apt 9(SEQ ID NO.3)：
[0011]5′‑
TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGGAGCCACGAGCGAGAGCGCACTACGGCGCCGAACTGCAGGTCGACGCATGCGCCG
‑3′
；
[0012]Apt 13(SEQ ID NO.4)：
[0013]5′‑
TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGAATACACTATGACTGTCGGAGGTCCGAGTGCGGGCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG
‑3′
。
[0014]进一步地，ssDNA适配体的3
′
端或5
′
端修饰有功能基团或分子，可为提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基等，这些功能基团或分子能够提高ssDNA适配体的稳定性。
[0015]本专利技术的ssDNA适配体通过以下方法筛选得到：
[0016]S1、用核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物对将单链DNA文库进行PCR扩增，构建双链DNA文库；
[0017]单链DNA文库中的序列在结构上均符合下述通式所示的结构特征：5
′‑
TAGGGAATTCGTCGACGGATCC
‑
N35
‑
CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG
‑3′
，其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N35代表长度为35个核苷酸的随机片段，
[0018]上游引物的核苷酸序列为：
[0019]5′‑
TAGGGAATTCGTCGACGGAT
‑3′
，
[0020]下游引物的核苷酸序列为：
[0021]5′‑
CGGCGCATGCGTCGACCTG
‑3′
，
[0022]上游引物和下游引物的其中一条修饰荧光基团，另一条修饰生物素；
[0023]S2、向S1步骤构建的双链DNA文库中加入链霉亲和素修饰的磁珠，构建固定于磁珠表面的双链DNA文库；
[0024]S3、向S2步骤构建的固定于磁珠表面的双链DNA文库中加入靶标6
′‑
唾液酸乳糖进行孵育，通过磁性分离获得含有单链DNA的上清液，测其荧光强度，同时取上清液作为PCR模板链用于下一轮PCR扩增，获取次级双链DNA文库；
[0025]S4、将S3步骤获得的次级双链DNA文库多次重复S2与S3步骤操作，通过检测荧光信号强度变化判断需要的重复次数，直至最后一轮PCR扩增后进行测序；
[0026]S5、从S4步骤获得的测序结果中筛选出对6
′‑
唾液酸乳糖具有高亲和力和高特异性的序列，得到特异性识别6
′‑
唾液酸乳糖的ssDNA适配体。
[0027]进一步地，在S3步骤中，以6
′‑
唾液酸乳糖为正筛靶标，以唾液酸和/或乳糖为反筛靶标。
[0028]进一步地，步骤S1构建的双链DNA文库为一端修饰有荧光基团，一端修饰有生物素的双链DNA文库。
[0029]本专利技术的ssDNA适配体可用于6
′‑
唾液酸乳糖检测的组合物、试剂盒、传感器或芯片中，本专利技术即构建了一种用于检测6
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唾液酸乳糖的生物传感器，包括上述ssDNA适配体中的一种或多种，还包括与ssDNA适配体完全互补的信号探针，发夹探针Hp1，发夹探针Hp2和量子点；其中，信号探针可触发发夹探针Hp1和发夹探针Hp2杂交形成DNA双链，发夹探针Hp1和发夹探针Hp2的其中一条探针上连接有荧光基团，另一条探针可与量子点连接。
[0030]进一步地，上述发夹探针中，其中一条探针上连接的荧光基团为FAM、Cy5等任何可以测量的荧光材料，另外一条探针通过生物素
‑
亲和素系统与量子点连接。本专利技术的一个实施例中，发夹探针Hp1上修饰生物素，发夹探针Hp2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性识别6'
‑
唾液酸乳糖的ssDNA适配体，其特征在于，所述ssDNA适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1
‑
4所示序列之一。2.权利要求1所述的ssDNA适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、用核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物对将单链DNA文库进行PCR扩增，构建双链DNA文库；所述单链DNA文库中的序列在结构上均符合下述通式所示的结构特征：5
′‑
TAGGGAATTCGTCGACGGATCC
‑
N35
‑
CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG
‑3′
，其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N35代表长度为35个核苷酸的随机片段，所述上游引物和下游引物的其中一条修饰荧光基团，另一条修饰生物素；S2、向S1步骤构建的双链DNA文库中加入链霉亲和素修饰的磁珠，构建固定于磁珠表面的双链DNA文库；S3、向S2步骤构建的固定于磁珠表面的双链DNA文库中加入靶标6'
‑
唾液酸乳糖进行孵育，通过磁性分离获得含有单链DNA的上清液，测其荧光强度，同时取上清液作为PCR模板链用于下一轮PCR扩增，获取次级双链DNA文库；S4、将S3步骤获得的次级双链DNA文库多次重复S2与S3步骤操作，通过检测荧光信号强度变化判断需要的重复次数，直至最后一轮PCR扩增后进行测序；S5、从S4步骤获得的测序结果中筛选出对6'
‑
唾液酸乳糖具有高亲和力和高特异性的序列，得到所述特异性识别6'
‑
唾液酸乳糖的ssDNA适配体。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：在S3步骤中，加入靶标6'
‑
唾液酸乳糖进行孵育时，加入唾液酸和/或乳糖作为反筛靶标。4.一种用于检测6'

【专利技术属性】
技术研发人员：周楠迪，陈金日，张雨婷，王晓丽，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：