一种肝癌诊断标志物及治疗靶点的应用制造技术

一种肝癌诊断标志物及治疗靶点的应用，本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体是一种circ RNA在肝细胞癌诊断及靶向治疗中的应用。所述circ RNA标志物为hsa_circRNA_0000384，研究发现肝细胞癌组织中hsa_circRNA_0000384的表达显著高于癌旁组织及正常组织，hsa_circRNA_0000384高表达暗示肝细胞癌患者的不良预后。同时本发明专利技术还涉及一种特异降低肝癌细胞系hsa_circRNA_0000384表达的siRNA,并证实其可以抑制肝癌细胞增殖与迁移，所述siRNA可作为肝细胞癌治疗的靶点。肝细胞癌治疗的靶点。

【技术实现步骤摘要】
一种肝癌诊断标志物及治疗靶点的应用


[0001]本专利技术属于生物技术和生物医学邻域，具体涉及hsa_circRNA_0000384作为肝细胞癌诊断的标志物和治疗靶点。

技术介绍

[0002]肝癌（Liver Cancer）是全球第六大常见癌症，也是致死率第四的癌症。2018年全球新增肝癌病例84.1万例，肝癌死亡病例78.2万例。中国恶性肿瘤流行情况分析显示2015年我国新增肝癌病例37万例，位列主要癌症新发病例第四位；肝癌死亡病例32.6万例，位列主要癌症死亡病例第二位。原发性肝癌主要分为肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC），占比为75%-85%；胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma），占比为10%-15%。早期肝细胞癌不易发现，多数肝细胞癌患者被确诊时已处于中晚期。肝癌的治疗主要以手术、放疗、化疗为主，但是预后较差，患者存活期普遍较短。目前尚未有特异的肝细胞癌早期诊断靶标及预后生物标志物，且肝细胞癌靶向治疗药物的研发依然没有实质突破。因此，寻找肝细胞癌早期诊断特异性标志物，同时以标记物为突破口研发肝细胞癌靶向药物意义重大。
[0003]环状RNA（circular RNA, circ RNA）与micro RNA、长链非编码RNA同属于非编码RNA家族，近年来环状RNA已经成为非编码RNA研究领域的热点，受到广泛关注。环状RNA是一类不具有游离的5'末端帽子和3'末端 poly (A)尾巴而主要依赖于反向剪接机制以共价键形式形成的闭合环状RNA分子。目前的研究结果表明，环状RNA在人体内广泛表达，且在不同组织器官中具有特异性，其主要作用是作为microRNA的内源竞争性结合分子调控下游基因的表达；作为RNA结合蛋白的诱饵调控RNA结合蛋白的功能；作为蛋白的脚手架分子调控蛋白的修饰；直接翻译多肽等。越来越多的证据表明环状RNA在肝细胞癌发生、发展中发挥着重要的作用，因此环状RNA有望成为肝细胞癌理想的诊断标志物和治疗靶点。

技术实现思路

[0004]为了实现肝细胞癌的早期诊断及靶向治疗，本专利技术提供了hsa_circRNA_0000384作为肝细胞癌早期诊断靶标及临床治疗靶点。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种环状RNA用于肝细胞癌诊断的标志物。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供一种肝细胞癌特异性诊断试剂盒。
[0007]本专利技术的第三个目的是提供一种环状RNA作为肝细胞癌的治疗靶点。
[0008]为实现第一个目的，本专利技术提供在肝细胞癌中显著高表达circRNA为生物标志物，所述标志物为hsa_circRNA_0000384。SEQ ID No.1所示，环化序列由420个碱基组成。
[0009]为实现第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：提供了一种基于荧光定量PCR的检测试剂盒，其中包含hsa_circRNA_0000384的特异检测引物。
[0010]荧光定量PCR的检测引物序列如下F: 5'-CCCCAGAGCACGAGTAGTAG-3'R: 5'-TGCTGCAACTGGGTAAACAC-3'
beta-actin内参引物序列如下F: 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3'R: 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'为实现第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：提供了一种在肝细胞癌细胞系中显著降低hsa_circRNA_0000384表达，且不影响hsa_circRNA_0000384来源基因MRPS35表达的siRNA，并利用肝癌细胞系验证了该siRNA通过降低hsa_circRNA_0000384表达抑制肝癌细胞的增殖和迁移。
[0011]hsa_circRNA_0000384特异siRNA序列如下F: 5'-GUAGUCUUAAGACGGAAAGTT-3'R: 5'-CUUUCCGUCUUAAGACUACTT-3'
附图说明
[0012]图1为环状RNA标志物的表达分析。
[0013]图2为用于荧光定量PCR检测hsa_circRNA_0000384表达的检测引物的融解曲线。
[0014]图3为siRNA敲降效率及特异性分析。
[0015]图4为降低hsa_circRNA_0000384表达抑制肝癌细胞的增殖和迁移。
[0016]具体实施方式
[0017]下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述。
[0018]下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
[0019]实施例11.1 样本的收集收集20例肝细胞癌患者癌组织和癌旁组织石蜡组织。
[0020]1.2 石蜡组织及细胞系总RNA的提取与反转录利用石蜡组织RNA提取试剂盒（天根公司）提取石蜡组织RNA，利用Nano Drop测定RNA浓度。利用Trizol法提取肝细胞系及肝癌细胞系的RNA，利用Nano Drop测定RNA浓度。
[0021]利用反转录试剂盒（TAKARA公司）进行反转录，体系如下：成分体积总RNA500ngRandomPrimer(50μM)0.5μLdNTPsMixture(10mM)0.5μL5xM-MLVBuffer2μLRNaseInhibitor（40U/μl）0.25μLRTaseM-MLV（RNaseH-）（200U/μl）0.5μLRNasefreeH2Oupto10μL反应条件30℃，10分钟；42℃，1小时；70℃，15分钟；冰上冷却，得到的cDNA溶液。
[0022]1.4 cDNA稀释反转录后，每孔加40 μL RNase free H2O稀释。
[0023]1.5 荧光定量PCR设计hsa_circRNA_0000384跨剪切点引物:设计合成了三对跨剪切点引物（由生工生物公司合成），进行PCR检测，从中优选引物扩增条带明确且单一的引物组合，如下：F: 5'-CCCCAGAGCACGAGTAGTAG-3'R: 5'-TGCTGCAACTGGGTAAACAC-3'PCR产物大小为137bp。经测序确定PCR产物正确。
[0024]利用SYBR Green Mixture（GenStar公司）以beta-actin为内参检测hsa_circRNA_0000384的相对表达，计算相对表达量。
[0025]荧光定量PCR体系成分体积2
×
SYBRGreenMixture5μLF引物(10μM)0.4μLR引物(10μM)0.4μLcDNA2μLRNasefreeH2O2.2μLPCR条件95℃，2min；40个PCR循环(95℃，15秒；60℃，15秒(收集荧光))。扩增反应结束后，从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒)，以获得PCR产物的熔解曲线。
[0026]实施例22.1 hsa_circRNA_0000384特本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于肝细胞癌诊断的circ RNA标志物，其特征在于，所述circ RNA标志物为hsa_circRNA_0000384。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，hsa_circRNA_0000384的核酸序列。3.一种肝细胞癌诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含检测患者肝组织中hsa_circRNA_0000384表达量的试剂。4.根据权利要求1和3所述用途，其特征在于：所述hsa_circRNA_0000384的特异性检测引物组合，包括一对针对hsa_c...

【专利技术属性】
技术研发人员：李向东，李鹏，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：