荔枝转基因体系的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种荔枝转基因体系的构建方法及其应用。通过本发明专利技术的构建方法在荔枝实生苗上成功构建了荔枝转基因体系，在荔枝的转基因技术和基因功能验证具有重要的应用价值，为荔枝的品种选育和品种改良提供的研究工具。为荔枝的品种选育和品种改良提供的研究工具。

【技术实现步骤摘要】
荔枝转基因体系的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种荔枝转基因体系的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]荔枝（Litchi chinensisSonn.）是原产于我国的重要经济常绿果树。荔枝营养丰富，具有优良的果实品质，因而备受消费者的喜爱。但是荔枝不耐贮运，并且稳产性不高，所以急需建立荔枝转基因体系，促进品种的选育和品种改良的进程。但目前的研究中，尚未报道荔枝实生苗上成功构建转基因体系。

技术实现思路

[0003]本专利技术的一个目的在于提供一种荔枝转基因体系的构建方法。
[0004]在一些实施方式中，所述荔枝转基因体系的构建方法包括以下步骤：步骤a：荔枝种子消毒后于无菌培养基中培养获得荔枝实生苗；步骤b：活化农杆菌得到侵染用农杆菌菌液，所述农杆菌中携带有目的基因；步骤c：使用所述农杆菌菌液创伤侵染荔枝实生苗；步骤d：恢复培养后荔枝实生苗上获得到转基因根。
[0005]在一些实施方式中，所述无菌培养基为1/2 MS培养基。
[0006]在一些实施方式中，所述荔枝实生苗是指苗期为20
‑
30天的荔枝实生苗；优选地，所述荔枝实生苗是指苗期为25天的荔枝实生苗。
[0007]在一些实施方式中，所述农杆菌为Ar.Qual发根农杆菌。
[0008]在一些实施方式中，所述农杆菌中含有筛选质粒；优选地，所述筛选质粒中含有报告基因RUBY；更优选地，所述报告基因RUBY由35S启动子引导表达。
[0009]报告基因RUBY中包括甜菜碱生物合成基因 CYP76AD1、DODA和葡萄糖基转移酶，这三个基因通过2A 肽相连。当其表达时可以产生甜菜碱生物合成所需的所有酶，可用于来追踪基因表达或可视化转基因。关于报告基因RUBY的描述详见：He, Yubing , Zhang, Tao , Sun, Hui , Zhan, Huadong , & Zhao, Yunde. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research, 2020, 7(1)。本专利技术中通过在农杆菌中转入含有报告基因RUBY的筛选质粒，可以非常简便直观地确认转基因是否成成功。
[0010]在一些实施方式中，所述步骤b具体为：将含有目的基因的农杆菌加入TY液体培养基，于28℃振荡培养2小时，离心重悬后，将菌液涂布在含有链霉素、卡那霉素的TY固体培养基上，28℃培养2天，挑单菌落于含有链霉素、卡那霉素和乙酰丁香酮的TY液体培养基中，28℃、220 rmp振荡培养得到侵染用农杆菌菌液。
[0011]在一些实施方式中，所述农杆菌菌液的OD
600
值为0.5
‑
0.7；优选地，所述农杆菌菌液的OD
600
值为0.6。
[0012]在一些实施方式中，所述步骤c具体为：使用注射器吸取所述农杆菌菌液创伤侵染
荔枝实生苗的茎，然后避光静置。
[0013]在一些实施方式中，所述步骤c具体为：使用注射器吸取所述农杆菌菌液创伤侵染荔枝实生苗的茎，然后避光静置30
‑
45min，然后再次使用注射器吸取所述农杆菌菌液创伤侵染荔枝实生苗的茎上同一伤口，然后避光静置1
‑
2h。
[0014]在一些实施方式中，步骤d中恢复培养的环境条件为：温度24
‑
26℃，暗培养8 h，光照培养16 h。
[0015]在一些实施方式中，步骤d中恢复培养的时间为2
‑
3周。
[0016]本专利技术的另一个目的在于提供上述荔枝转基因体系的构建方法在荔枝品种选育及荔枝品种改良中的应用。
[0017]本专利技术的有益效果是：通过本专利技术的构建方法在荔枝实生苗上成功构建了荔枝转基因体系，在荔枝的转基因技术和基因功能验证具有重要的应用价值，为荔枝的品种选育和品种改良提供的研究工具。
附图说明
[0018]图1在荔枝实生苗茎上侵染发根农杆菌；图2Ar.Qual发根农杆菌侵染荔枝实生苗诱导的转基因根；图3含有pro35S:RUBY质粒的Ar.Qual发根农杆菌侵染荔枝实生苗诱导的转基因根；图4含有pro35S:RUBY质粒的Ar.Qual发根农杆菌侵染荔枝实生苗。
具体实施方式
[0019]以下结合附图和具体实施方式对本专利技术进行更全面的说明，但本专利技术的实施方式并不局限于此。
[0020]实施例1荔枝实生苗的获得一、荔枝种子的消毒方法：在市场上购买荔枝，首先将成熟的荔枝种子剥去果肉，用清水洗干净，去除多余的果肉。在超菌工作台上，将洗干净的种子置于75 %的酒精中浸泡2 min，用无菌水（利用高压灭菌锅121 ℃，15 min）冲洗一遍，再将种子置于3% NaClO3（将购买的NaClO3, 用无菌水稀释至浓度为2%） 30 min，用无菌水冲洗4
‑
5遍，然后将种子播种于1/2 MS（1/2 MS基础培养基（coolaber），7 g/L琼脂粉，pH=5.7）培养基的培养瓶中，每一个培养瓶中放置一个种子。此消毒方法能达到荔枝种子污染率为0。
[0021]二、荔枝种子的培养：将培养瓶置于培生化养箱中，其培养条件为：温度24℃，黑暗培养8 h，光照培养16 h。
[0022]实施例2农杆菌的培养一、Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S 启动子（后续缩写为pro35S）的克隆：利用Primer Premier 5.0软件设计pro35S全长序列的上下游引物如下：35S
‑
F：CATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAG（SEQ ID NO.：1），35S
‑
R：AGTCCCCCGTGTTCTCTCCAAATG（SEQ ID NO.：）2，利用ApexHF HS DNA Polymerase FS Master Mix（艾科瑞生物）进行pro35S全长序列的扩增。PCR反应体系为：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，退火温度55℃、30 s，72℃延
伸1 min，共35个循环；72℃继续延伸2 min。待反应结束后取1μLPCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，送至艾基生物公司进行测序。pro35S启动子的序列为：CATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荔枝转基因体系的构建方法，包括以下步骤：步骤a：荔枝种子消毒后于无菌培养基中培养获得荔枝实生苗；步骤b：活化农杆菌得到侵染用农杆菌菌液，所述农杆菌中携带有目的基因；步骤c：使用所述农杆菌菌液创伤侵染荔枝实生苗；步骤d：恢复培养后荔枝实生苗上获得到转基因根。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述无菌培养基为1/2 MS培养基。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述荔枝实生苗是指苗期为20
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30天的荔枝实生苗；优选地，所述荔枝实生苗是指苗期为25天的荔枝实生苗。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述农杆菌为Ar.Qual发根农杆菌。5.根据权利要求1或4所述的构建方法，其特征在于，所述农杆菌中含有筛选质粒；优选地，所述筛选质粒中含有报告基因RUBY；更优选地，所述报告基因RUBY由35S启动子引导表达。6.根据权利要求1或4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤b具体为：将含有目的基因的农...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵明磊，谢涵涵，李建国，徐珊珊，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：