植物细胞转基因纳米载体的制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种植物细胞转基因纳米载体的制备和应用，属于纳米载体技术领域，本发明专利技术制备了两种尺寸的介孔硅纳米颗粒，氨基修饰后对其进行表征，并负载含smGFP基因的质粒DNA对拟南芥原生质体进行细胞转导。结果表明：Am

【技术实现步骤摘要】
植物细胞转基因纳米载体的制备和应用


[0001]本专利技术涉及纳米载体
，特别是涉及一种植物细胞转基因纳米载体的制备和应用。

技术介绍

[0002]遗传转化是植物分子育种和功能基因组研究的重点工作之一。研发稳定、高效的遗传转化新方法，是遗传育种、分子生物学和基因工程等领域长期关注的焦点问题。目前，基因枪轰击、农杆菌侵染和病毒侵染等是常用的传统植物遗传转化方法。但是，这些方法存在一些不足之处。例如基因枪轰击法具有成本高；容易形成嵌合体，造成转基因的失活或沉默；所需外源DNA量大以及植物组织损伤大等缺点。农杆菌介导转化受体物种有限，并且易产生随机插入造成非目标基因功能失活。对于大多数木本植物或顽拗型基因型的植物来说，仍存在遗传转化技术难题。利用植物病毒介导法对植物基因进行遗传转化效率比较高，但其安全性受到质疑，目前该方法主要用于动物的基因转移。
[0003]近年来，随着纳米技术的快速发展，纳米材料作为基因载体在植物遗传转化、动物细胞和医学治疗等领域得到了广泛的应用。纳米材料具备独特的理化性质，表面能大大增加，易与其他原子结合变稳定，粒子上的官能团密度和选择性吸附能力变大，可以通过表面修饰精准地调控其与生物分子(如DNA、RNA以及蛋白)的相互作用。另外，零维和一维的纳米材料可以不借助外力穿透细胞膜，容易进入到植物细胞的内部，使得它成为重要生物分子极佳的传送载体。利用不同化学基团对纳米颗粒表面进行功能化修饰，通过物理或化学亲和作用装载或者吸附靶向外源DNA等核酸分子，构建成纳米核酸复合物。然后，通过静电吸附或化学键作用与细胞受体结合，利用细胞胞吞作用将纳米复合物导入植物细胞，释放外源目的基因，最终实现纳米载体介导的植物遗传转化，是一种具有高效性创新的植物转基因技术。与传统方法相比较，纳米载体不仅能够对蛋白、DNA和RNA等多种生物分子进行有效保护，还可以方便、快捷、高效地把靶标分子导入植物愈伤、胚乳等不同组织，对单子叶植物和双子叶植物都能转导，并且能够进行多基因同时转化。
[0004]在众多的转基因纳米材料中，介孔硅纳米粒(mesoporous silica nanoparticles，MSNs)因具有颗粒大小均匀、比表面积大、高装载量、易于修饰的内外表面、高稳定性以及良好的生物相容性等特点，正被逐渐用于植物转基因载体材料。2007年，Torney等利用MSNs装载绿色荧光蛋白(GFP)基因，用金纳米粒子进行封堵，利用基因枪将纳米复合物导入烟草叶片细胞，首次实现了MSNs介导基因在植物细胞的转化。此外，Martin
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Ortigosa等利用MSNs装载Cre酶蛋白，在借助基因枪外力作用下，将靶基因导入玉米胚中，并且实现了目的基因的表达。MSNs表面进行聚乙烯亚胺修饰后用于装载GUS基因，然后与烟草悬浮细胞混合培养，并且通过超声波处理，目的基因被导入到烟草细胞中并得到了成功表达。不少研究也表明，外源生物分子在无机械无外力辅助下也可通过纳米材料透过细胞壁实现细胞内化。例如，Chang等将mCherry蛋白和GFP蛋白基因装载于MSNs，在不借助外力的情况下，纳米复合物穿透拟南芥根部而进入到植株细胞内。利用激光共聚焦显微镜检查
发现，目的基因在根系的表皮层以及更深层次的皮质和内胚层根组织都实现了表达。
[0005]然而，MSNs具有较高的表面自由能，大量活性羟基导致其亲水性强，极易发生集聚现象，以至于在有机相中的MSNs分散不均，从而影响材料的结构与性能。另外，MSNs表面带有大量负电荷，不利于装载和吸附同样带负电荷的核酸分子。因此，有必要通过一定的技术手段对MSNs表面进行化学或物理修饰。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种植物细胞转基因纳米载体的制备和应用，以解决上述现有技术存在的问题。
[0007]本专利技术采用软模板法，以十六烷基三甲基溴化铵为模板剂，正硅酸乙酯为硅源，合成了两种直接分别为20nm和50nm介孔硅纳米粒(MSNs)。利用3
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氨基丙基三乙氧基硅烷对MSNs表面进行修饰，对其进行形态、红外光谱和电位表征。通过凝胶阻滞实验测试两种氨基化的介孔硅纳米粒对靶标基因的装载性能和保护性能；作为递送绿色荧光蛋白(GFP)标记的质粒DNA的载体，对拟南芥原生质体进行细胞转导，在荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白基因的瞬时表达情况，综合评估两种不同MSNs作为基因载体的效率。以期为纳米基因载体在植物转基因中的研究与应用提供新的材料和理论依据。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0009]本专利技术提供一种植物细胞转基因纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
[0010](1)将十六烷基三甲基溴化铵溶于超纯水中，调节pH，升温剧烈搅拌后，冷却；逐滴加入正硅酸乙酯，搅拌反应，保温，得反应液；
[0011](2)将所述反应液过滤，固体产物分散于含有氯化氢的酒精中，搅拌条件下水浴，之后离心，固体产物洗涤，干燥，得到介孔硅纳米粒；
[0012](3)将所述介孔硅纳米粒分散在乙醇中，超声均匀后，剧烈搅拌，然后逐滴加入3
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氨基丙基三乙氧基硅烷反应，之后加超纯水，剧烈搅拌继续反应，离心，洗涤，干燥，得到氨基化硅纳米粒，即为植物细胞转基因纳米载体。
[0013]进一步地，在步骤(1)中，所述调节pH具体为采用氨水调节pH至10；所述升温剧烈搅拌具体为80℃剧烈搅拌30min；所述冷却为冷却至30℃。
[0014]进一步地，在步骤(1)中，所述搅拌反应的时间为24h；所述保温为80℃烘箱中保温24h。
[0015]进一步地，在步骤(2)中，所述过滤采用硝酸纤维素膜过滤，所述硝酸纤维素膜的孔径为0.1μm；所述含有氯化氢的酒精的配制方法为将1mL氯化氢溶液加入到100mL酒精中，所述氯化氢溶液的质量浓度为32％。
[0016]进一步地，在步骤(2)中，所述水浴的温度为60℃；所述离心为9000rpm离心10min；所述干燥为真空干燥12h。
[0017]进一步地，在步骤(1)中，剧烈搅拌过程中，还加入1,3,5
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三甲苯。
[0018]本专利技术还提供一种上述的植物细胞转基因纳米载体的制备方法制备得到的植物细胞转基因纳米载体。
[0019]本专利技术还提供一种上述的植物细胞转基因纳米载体作为植物基因载体的应用。
[0020]进一步地，所述植物细胞转基因纳米载体用于负载质粒DNA对原生质体进行细胞
转导。
[0021]进一步地，所述原生质体为拟南芥原生质体。
[0022]为了使纳米颗粒具有生物活性，需要通过引入某些特殊官能团，使MSNs粒子表面的硅羟基和不饱和键与所需基团发生反应，接枝有机分子链段，减少其表面的硅羟基含量，增加其与聚合物之间的相容性，降低表面极性以提高其水溶性和分散性。本专利技术采用3
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氨基丙基三乙氧基硅烷对MSNs进行表面修饰，枝接大量氨基基团，从而携带高密度的正电荷。作为载体的氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植物细胞转基因纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将十六烷基三甲基溴化铵溶于超纯水中，调节pH，升温剧烈搅拌后，冷却；逐滴加入正硅酸乙酯，搅拌反应，保温，得反应液；(2)将所述反应液过滤，固体产物分散于含有氯化氢的酒精中，搅拌条件下水浴，之后离心，固体产物洗涤，干燥，得到介孔硅纳米粒；(3)将所述介孔硅纳米粒分散在乙醇中，超声均匀后，剧烈搅拌，然后逐滴加入3
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氨基丙基三乙氧基硅烷反应，之后加超纯水，剧烈搅拌继续反应，离心，洗涤，干燥，得到氨基化硅纳米粒，即为植物细胞转基因纳米载体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述调节pH具体为采用氨水调节pH至10；所述升温剧烈搅拌具体为80℃剧烈搅拌30min；所述冷却为冷却至30℃。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述搅拌反应的时间为24h；所述保温为80℃烘箱中保温24h。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆新华，孙德权，张秀梅，胡会刚，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，
类型：发明
国别省市：