测定人血浆中溴夫定浓度的方法技术

本发明专利技术属于医药检测技术领域，公开一种测定人血浆中溴夫定浓度的方法，步骤如下：配制溴夫定标准曲线储备液、质控储备液和内标储备溶液；使用溴夫定标准曲线储备液配制溴夫定标准工作液，用制备好的溴夫定标准工作液和空白基质配制标准曲线血浆样品；用质控储备液配制溴夫定质控工作液，用制备好的溴夫定质控工作液和空白基质配制质控样品；用内标储备溶液配制内标工作溶液；采用LC

【技术实现步骤摘要】
测定人血浆中溴夫定浓度的方法


[0001]本专利技术涉及医药检测
，具体涉及一种测定人血浆中溴夫定浓度的方法。

技术介绍

[0002]溴夫定，是用于治疗免疫功能正常的成年急性带状疱疹患者的药品。
[0003]带状疱疹是由潜伏的水痘
‑
带状疱疹病毒(VZV)重新激活引起的感染性皮肤病，好发于中老年人，常表现为沿感觉神经支配的区域形成单侧皮疹，并伴有神经病理性疼痛。随着我国人口老龄化趋势日益加重，带状疱疹的发病率呈显著上升趋势，带状疱疹的防治已经成为重要的公共卫生问题。溴夫定为一无药理活性的物质，进行一系列的磷酸化，在细胞内的磷酸转化过程由病毒胸苷激酶催化，最终形成溴夫定三磷酸盐，可以抑制VZV的复制。
[0004]溴夫定抗病毒活性是阿昔洛韦和喷昔洛韦的200
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1000倍，且是单次治疗方案，半衰期长，起效快，肾功能不全患者应用溴夫定无需剂量调整，针对带状疱疹病毒具有高度的选择性，能明显降低带状疱疹后遗神经痛的发生风险。具有极大的临床优势。
[0005]现有发表的检测血浆中溴夫定的方法有HPLC
‑
UV或毛细管电泳，在实际运用过程中存在检测时间过长、灵敏度不足等局限性。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种测定人血浆中溴夫定浓度的方法，采用LC
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MS/MS法测定人血浆中溴夫定浓度，克服了较低浓度水平的精准定量检测的缺陷，能满足较小给药量时生物体内的含量测定要求，检测过程中信噪比符合标准要求，无杂质峰的干扰，测定的药物的含量准确度高。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一方面，本专利技术提供一种测定人血浆中溴夫定浓度的方法，包括如下步骤：
[0009]步骤一：配制溴夫定标准曲线储备液、质控储备液和内标储备溶液；
[0010]步骤二：使用溴夫定标准曲线储备液配制溴夫定标准工作液，用制备好的溴夫定标准工作液和空白基质配制标准曲线血浆样品；用质控储备液配制溴夫定质控工作液，用制备好的溴夫定质控工作液和空白基质配制质控样品；用内标储备溶液配制内标工作溶液；
[0011]步骤三：采用LC
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MS/MS法对溴夫定标准曲线血浆样品、质控样品和内标工作溶液进行测定，获得标准曲线方程；采用LC
‑
MS/MS法对未知生物样品进行测定，根据标准曲线方程确定未知生物样品中溴夫定的含量。
[0012]进一步地，所述溴夫定标准曲线储备液的配制方法如下：称取溴夫定，加入甲醇溶解后制得。进一步地，所述溴夫定标准曲线储备液的浓度为1mg/mL。
[0013]进一步地，所述溴夫定标准曲线血浆样品的配制方法如下：取溴夫定标准曲线储备液采用浓度为50％的甲醇水溶液进行配制成溴夫定标准工作液，用制备好的溴夫定标准工作液和空白基质配制标准曲线血浆样品。进一步地，所述溴夫定标准工作液的浓度范围
为200～80000ng/mL。
[0014]进一步地，所述标准曲线血浆样品的浓度范围为10～4000ng/mL。
[0015]进一步地，所述质控样品的配制方法如下：称取溴夫定，加入甲醇溶解后制得质控储备液；取质控储备液采用浓度为50％的甲醇水溶液进行配制成溴夫定质控工作液，用制备好的溴夫定质控工作液和空白基质配制质控样品。进一步地，所述溴夫定质控工作液的浓度范围为200～200000ng/mL。
[0016]进一步地，所述质控样品的浓度范围为10～10000ng/mL。
[0017]进一步地，所述内标工作溶液配制过程如下：称取氢氯噻嗪，加入甲醇溶解后，采用浓度50％的甲醇水溶液配制成内标工作溶液。进一步地，所述内标工作溶液的浓度为1000ng/mL。内标选择了同为负离子且分子量接近的氢氯噻嗪，该化合物稳定性好、响应高并稳定，相同梯度下保留时间与溴夫定相近。相比其他内标物，例如氘代溴夫定，氢氯噻嗪成本更低；例如双氯芬酸，氢氯噻嗪的母离子与溴夫定接近，保留时间在相同梯度下与溴夫定界定，检测获得的响应值高且稳定。
[0018]进一步地，所述标准曲线血浆样品在进行检测前的预处理方法如下：取标准曲线血浆样品涡旋1min，取乙腈沉淀剂封板涡旋3min，离心，4℃，2450g，10min，吸取上清液，加入超纯水，涡旋后待进样检测。
[0019]进一步地，所述LC
‑
MS/MS法的条件如下：
[0020]色谱条件
[0021]色谱柱：Agilent poroshell EC
‑
C18 2.7μm(3.0*50mm)；
[0022]流动相A：0.1％甲酸溶液；流动相B：乙腈；
[0023]流速：0.400mL/min；停止时间：4.00min；
[0024]洗针液冲洗：5s；进样量：5μL；柱温：40℃；
[0025]流动相比例设置如下：
[0026]TimeABMaxPressure10.00min90％10％1300bar20.20min90％10％1300bar32.00min10％90％1300bar43.00min10％90％1300bar53.01min90％10％1300bar64.00min90％10％1300bar
[0027]质谱条件
[0028]采用ESI源，负离子MRM模式检测：
[0029][0030]离子源参数设置如下：
[0031]ParameterValueIS
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4500Gas 150Gas 250CAD8CUR30Temp(℃)450
[0032]。
[0033]本专利技术采用的流动相A和流动相B对于提高响应具有重要意义，不会对质谱仪产生污染，更不会影响质谱仪寿命。本专利技术的流动相采用梯度洗脱的方式，相比等度洗脱，梯度洗脱的方法更稳定，且无基质效应。本专利技术采用AgilentporoshellEC
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C182.7μm(3.0*50mm)作为色谱柱，检测的溴夫定的峰形更对称，响应度更高。
[0034]进一步地，所述标准曲线回归方程如下：
[0035]测得的溴夫定在人血浆中的标准曲线回归方程为：y＝0.000608x+0.000562，R为0.9995；溴夫定的线性范围为10～4000ng/mL，溴夫定的血药浓度的最低定量下限为10ng/mL。
[0036]本专利技术选择色谱柱：Agilent poroshell EC
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C182.7μm(3.0*50mm)，对于本申请中测定血浆中溴夫定的低浓度响应值更高，峰形较好，对称且不拖尾，出峰时间不会太靠前，也不会太靠后，刚好合适；能轻易洗脱待测物，有效缩短实验时间。
[0037]考虑流速对药物出峰时间的影响以及进样量过大导致出峰效果的影响，本专利技术选择流速为0.400mL/min，采用进样量为5μL，不仅可保证药物出本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定人血浆中溴夫定浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：配制溴夫定标准曲线储备液、质控储备液和内标储备溶液；步骤二：使用溴夫定标准曲线储备液配制溴夫定标准工作液，用制备好的溴夫定标准工作液和空白基质配制标准曲线血浆样品；用质控储备液配制溴夫定质控工作液，用制备好的溴夫定质控工作液和空白基质配制质控样品；用内标储备溶液配制内标工作溶液；步骤三：采用LC
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MS/MS法对溴夫定标准曲线血浆样品、质控样品和内标工作溶液进行测定，获得标准曲线方程；采用LC
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MS/MS法对未知生物样品进行测定，根据标准曲线方程确定未知生物样品中溴夫定的含量。2.根据权利要求1所述测定人血浆中溴夫定浓度的方法，其特征在于，所述溴夫定标准曲线储备液的配制方法如下：称取溴夫定，加入甲醇溶解后制得。3.根据权利要求2所述测定人血浆中溴夫定浓度的方法，其特征在于，所述溴夫定标准曲线血浆样品的配制方法如下：取溴夫定标准曲线储备液采用浓度为50％的甲醇水溶液进行配制成溴夫定标准工作液，用制备好的溴夫定标准工作液和空白基质配制标准曲线血浆样品。4.根据权利要求3所述测定人血浆中溴夫定浓度的方法，其特征在于，所述溴夫定标准曲线储备液的浓度为1mg/mL，所述溴夫定标准工作液的浓度范围为200～80000ng/mL，所述标准曲线血浆样品的浓度范围为10～4000ng/mL。5.根据权利要求1所述测定人血浆中溴夫定浓度的方法，其特征在于，所述质控样品的配制方法如下：称取溴夫定，加入甲醇溶解后制得质控储备液；取质控储备液采用浓度为50％的甲醇水溶液进行配制成溴夫定质控工作液，用制备好的溴夫定质控工作液和空白基质配制质控样品；所述溴夫定质控工作液的浓度范围为200～200000ng/mL；所述质控样品的浓度范围为10～10000ng/mL。6.根据权利要求1所述测定人血浆中溴夫定浓度的方法，其特征在于，所述内标工作溶液配制过程如下：称取氢氯噻嗪，加入甲醇溶解后，采用浓度50％的甲醇水溶液配制成内标工作溶液；所述内标工作溶液的浓度为1000ng/mL。7.根据权利要求1所述测定人血浆中溴夫定浓度的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张侨侨，尹小丽，
申请(专利权)人：湖南慧泽生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：