一种编辑核酸的系统及方法技术方案

本申请涉及用于编辑核酸的系统和试剂盒及其用途，以及编辑核酸的方法。本申请的系统、试剂盒和方法可用于断裂双链靶核酸并在其末端形成悬突，并且可用于在感兴趣的核酸分子(例如基因组DNA)中插入靶核酸或将感兴趣的核酸分子(例如基因组DNA)中的核苷酸片段置换为靶核酸。靶核酸。靶核酸。

【技术实现步骤摘要】
一种编辑核酸的系统及方法


[0001]本申请涉及基因工程和分子生物学领域。特别地，本申请涉及用于编辑核酸的系统和试剂盒及其用途，以及编辑核酸的方法。本申请的系统、试剂盒和方法可用于断裂双链靶核酸并在其末端(特别是断裂的末端)形成悬突，并且可用于在感兴趣的核酸分子(例如基因组DNA)中插入靶核酸或将感兴趣的核酸分子(例如基因组DNA)中的核苷酸片段置换为靶核酸。

技术介绍

[0002]基因编辑技术是生物医学研究的热门领域，在遗传性疾病的临床治疗、动物模型的构建、农作物的遗传育种等方面具有广阔的应用前景。基因编辑技术包括在基因组特异位点上，对单个核苷酸或一段DNA序列进行删除、添加和替换等操作。外源基因的定点敲入可以通过同源重组(HDR，homologous dependent recombination)实现：在外源基因的两侧各引入一段500
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3000bp的同源臂，可以实现外源基因精确的定点整合，但其效率极低，只有0.01％左右。通过人工构建的核酸酶如ZFN(zinc
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finger nucleases)、T本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种系统或试剂盒，其包含下述四种组分：(1)第一Cas蛋白或含有编码所述第一Cas蛋白的核苷酸序列的核酸分子A1，其中，所述第一Cas蛋白能够切割或断裂第一双链靶核酸；(2)依赖于模板的第一DNA聚合酶或含有编码所述第一DNA聚合酶的核苷酸序列的核酸分子B1；(3)第一gRNA或含有编码所述第一gRNA的核苷酸序列的核酸分子C1，其中，所述第一gRNA能够与所述第一Cas蛋白结合，并形成第一功能性复合物；所述第一功能性复合物能够将第一双链靶核酸的两条链断裂，形成断裂的靶核酸片段；(4)第一标签引物或含有编码所述第一标签引物的核苷酸序列的核酸分子D1，其中，所述第一标签引物含有第一标签序列和第一靶结合序列，所述第一标签序列位于所述第一靶结合序列的上游或5
’
端；并且，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一靶结合序列能够杂交或退火至所述断裂的靶核酸片段的一条核酸链的3
’
端，形成双链结构，且，所述第一标签序列不与所述靶核酸片段结合，处于游离的单链状态。2.权利要求1的系统或试剂盒，其中，所述第一Cas蛋白选自Cas9蛋白、Cas12a蛋白、cas12b蛋白、cas12c蛋白、cas12d蛋白、cas12e蛋白、cas12f蛋白、cas12g蛋白、cas12h蛋白、cas12i蛋白、cas14蛋白、Cas13a蛋白、Cas1蛋白、Cas1B蛋白、Cas2蛋白、Cas3蛋白、Cas4蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas7蛋白、Cas8蛋白、Cas10蛋白、Csy1蛋白、Csy2蛋白、Csy3蛋白、Cse1蛋白、Cse2蛋白、Csc1蛋白、Csc2蛋白、Csa5蛋白、Csn2蛋白、Csm2蛋白、Csm3蛋白、Csm4蛋白、Csm5蛋白、Csm6蛋白、Cmr1蛋白、Cmr3蛋白、Cmr4蛋白、Cmr5蛋白、Cmr6蛋白、Csb1蛋白、Csb2蛋白、Csb3蛋白、Csx17蛋白、Csx14蛋白、Csx10蛋白、Csx16蛋白、CsaX蛋白、Csx3蛋白、Csx1蛋白、Csx15蛋白、Csf1蛋白、Csf2蛋白、Csf3蛋白、Csf4蛋白及其同源物或其修饰形式；优选地，所述第一Cas蛋白能够断裂第一双链靶核酸，并产生粘末端或平末端；优选地，所述第一Cas蛋白为Cas9蛋白，例如酿脓链球菌(S.pyogenes)的Cas9蛋白(spCas9)；优选地，所述第一Cas蛋白具有SEQ ID NO:1示的氨基酸序列。3.权利要求1或2的系统或试剂盒，其中，所述第一DNA聚合酶选自依赖于DNA的DNA聚合酶和依赖于RNA的DNA聚合酶；优选地，所述第一DNA聚合酶为依赖于RNA的DNA聚合酶；优选地，所述第一DNA聚合酶为逆转录酶，例如来自莫洛尼氏鼠白血病病毒人免疫缺陷病毒(HIV)，禽肉瘤
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白血病病毒(ASLV)，Rous肉瘤病毒(RSV)，禽成髓细胞增多症病毒(AMV)，禽成红细胞增多症病毒辅助病毒，禽粒细胞瘤病毒MC29辅助病毒，禽网状内皮组织增生病毒辅助病毒，禽肉瘤病毒UR2辅助病毒，禽肉瘤病毒Y73辅助病毒，Rous相关病毒和成髓细胞增多相关病毒(MAV)的逆转录酶；优选地，所述第一DNA聚合酶具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。4.权利要求1
‑
3任一项的系统或试剂盒，其中，所述第一Cas蛋白与所述第一DNA聚合酶相连接；优选地，所述第一Cas蛋白通过接头或者不通过接头与所述第一DNA聚合酶共价相连接；优选地，所述接头为肽接头，例如柔性肽接头；例如，所述接头具有SEQ ID NO:51所示
的氨基酸序列；优选地，所述第一Cas蛋白通过肽接头或者不通过肽接头与所述第一DNA聚合酶融合，形成第一融合蛋白；优选地，所述第一Cas蛋白任选地通过接头连接或融合至所述第一DNA聚合酶的N端；或者，所述第一Cas蛋白任选地通过接头连接或融合至所述第一DNA聚合酶的C端；优选地，所述第一融合蛋白具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。5.权利要求1
‑
4任一项的系统或试剂盒，其中，所述第一gRNA含有第一引导序列，并且，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一引导序列能够杂交或退火至第一双链靶核酸的一条核酸链；优选地，所述第一引导序列的长度为至少5nt，例如5
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10nt，10
‑
15nt，15
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20nt，20
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25nt，25
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30nt，30
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40nt，40
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50nt，50
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100nt，100
‑
200nt，或者更长；优选地，所述第一gRNA还含有第一支架序列，其能够被所述第一Cas蛋白识别并结合，从而形成第一功能性复合物；优选地，所述第一支架序列的长度为至少20nt，例如20
‑
30nt，30
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40nt，40
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50nt，50
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100nt，100
‑
200nt，或者更长；优选地，所述第一引导序列位于所述第一支架序列的上游或5
’
端；优选地，所述第一功能性复合物在所述第一引导序列与第一双链靶核酸结合后，能够将第一双链靶核酸的两条链断裂。6.权利要求1
‑
5任一项的系统或试剂盒，其中，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一靶结合序列能够杂交或退火至所述断裂的靶核酸片段的一条核酸链的3
’
端，并且所述3
’
端是因所述第一功能性复合物断裂所述第一双链靶核酸而形成的；优选地，所述第一靶结合序列的长度为至少5nt，例如5
‑
10nt，10
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15nt，15
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20nt，20
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25nt，25
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30nt，30
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40nt，40
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50nt，50
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100nt，100
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200nt，或者更长；优选地，所述第一标签序列的长度为至少4nt，例如4
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10nt，10
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15nt，15
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20nt，20
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25nt，25
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30nt，30
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40nt，40
‑
50nt，50
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100nt，100
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200nt，或者更长；优选地，在所述第一靶结合序列杂交或退火到所述断裂的靶核酸片段的一条核酸链的3
’
端后，所述第一DNA聚合酶能够以第一标签引物为模板，延伸所述核酸链的3
’
端；优选地，所述延伸形成第一悬突；优选地，所述第一标签引物为单链脱氧核糖核酸或者单链核糖核酸；优选地，所述第一标签引物为单链核糖核酸，并且所述第一DNA聚合酶为依赖于RNA的DNA聚合酶；或者，所述第一标签引物为单链脱氧核糖核酸，并且所述第一DNA聚合酶为依赖于DNA的DNA聚合酶；优选地，所述第一引导序列结合的核酸链与所述第一靶结合序列结合的核酸链是不同的；优选地，所述第一引导序列结合的核酸链是所述第一靶结合序列结合的核酸链的相对链。7.权利要求1
‑
6任一项的系统或试剂盒，其中，所述第一标签引物与所述第一gRNA相连接；优选地，所述第一标签引物通过接头或者不通过接头与所述第一gRNA共价相连接；优选地，所述第一标签引物任选地通过接头连接至所述第一gRNA的3
’
端；
优选地，所述接头为核酸接头(例如核糖核酸接头或脱氧核糖核酸接头)；优选地，所述第一标签引物为单链核糖核酸，并且，其通过核糖核酸接头或者不通过核糖核酸接头与所述第一gRNA的3
’
端相连接，形成第一PegRNA。8.权利要求1
‑
7任一项的系统或试剂盒，其具有选自下列的一项或多项技术特征：(1)所述核酸分子A1能够在细胞中表达所述第一Cas蛋白；(2)所述核酸分子B1能够在细胞中表达所述第一DNA聚合酶；(3)所述核酸分子C1能够在细胞中转录出所述第一gRNA；(4)所述核酸分子D1能够在细胞中转录出所述第一标签引物；优选地，所述核酸分子A1包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分子A1为含有编码所述第一Cas蛋白的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)；优选地，所述核酸分子B1包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分子B1为含有编码所述第一DNA聚合酶的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)；优选地，所述核酸分子C1包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分子C1为含有编码所述第一gRNA的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)；优选地，所述核酸分子D1包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分子D1为含有编码所述第一标签引物的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)；优选地，所述核酸分子A1和核酸分子B1包含于相同或不同的表达载体(例如，真核表达载体)中；优选地，所述核酸分子A1和核酸分子B1在细胞中能够表达分离的所述第一Cas蛋白和所述第一DNA聚合酶，或者能够表达含有所述第一Cas蛋白和所述第一DNA聚合酶的第一融合蛋白；优选地，所述核酸分子C1和核酸分子D1包含于相同的表达载体(例如，真核表达载体)中；优选地，所述核酸分子C1和核酸分子D1在细胞中能够转录出含有所述第一gRNA和所述第一标签引物的第一PegRNA；优选地，所述核酸分子A1、B1、C1和D1中的两个、三个或四个包含于相同的表达载体(例如，真核表达载体)中。9.权利要求1
‑
8任一项的系统或试剂盒，其中，所述系统或试剂盒包含：(M1
‑
1)含有所述第一Cas蛋白和所述第一DNA聚合酶的第一融合蛋白，或者，含有编码所述第一融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；或，(M1
‑
2)分离的所述第一Cas蛋白和第一DNA聚合酶，或者，能够表达分离的所述第一Cas蛋白和第一DNA聚合酶的核酸分子；和，(M2)含有所述第一gRNA和第一标签引物的第一PegRNA，或者，含有编码所述第一PegRNA的核苷酸序列的核酸分子。10.权利要求1
‑
9任一项的系统或试剂盒，其中，所述系统或试剂盒还包含：(5)第二gRNA或含有编码所述第二gRNA的核苷酸序列的核酸分子C2，其中，所述第二gRNA能够与第二Cas蛋白结合，并形成第二功能性复合物；所述第二功能性复合物能够将第二双链靶核酸的两条链断裂，形成断裂的靶核酸片段；优选地，所述第二Cas蛋白与所述第一Cas蛋白相同或者不同；优选地，所述第二Cas蛋白与所述第一Cas蛋白相同；优选地，所述第二gRNA含有第二引导序列，并且，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第二引导序列能够杂交或退火到第二双链靶核酸的一条核酸链；
优选地，所述第二功能性复合物在所述第二引导序列与第二双链靶核酸结合后，将第二双链靶核酸的两条链断裂；优选地，所述第二引导序列与所述第一引导序列不同；优选地，所述第二双链靶核酸与所述第一双链靶核酸相同或者不同；优选地，所述第二双链靶核酸与所述第一双链靶核酸是相同的，并且，所述第二功能性复合物与所述第一功能性复合物在不同的位置断裂所述相同的双链靶核酸；优选地，所述第二功能性复合物与所述第一功能性复合物断裂相同的双链靶核酸，并且，所述第一引导序列结合的核酸链与所述第二引导序列结合的核酸链是不同的；优选地，所述第一引导序列结合的核酸链是所述第二引导序列结合的核酸链的相对链；优选地，所述第二引导序列的长度为至少5nt，例如5
‑
10nt，10
‑
15nt，15
‑
20nt，20
‑
25nt，25
‑
30nt，30
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40nt，40
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50nt，50
‑
100nt，100
‑
200nt，或者更长；优选地，所述第二gRNA还含有第二支架序列，其能够被所述第二Cas蛋白识别并结合，从而形成第二功能性复合物；优选地，所述第二支架序列的长度为至少20nt，例如20
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30nt，30
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40nt，40
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50nt，50
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100nt，100
‑
200nt，或者更长；优选地，所述第二支架序列与所述第一支架序列相同或者不同；优选地，所述第二支架序列与所述第一支架序列相同；优选地，所述第二引导序列位于所述第二支架序列的上游或5
’
端；优选地，所述核酸分子C2能够在细胞中转录出所述第二gRNA；优选地，所述核酸分子C2包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分子C2为含有编码所述第二gRNA的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)。11.权利要求10的系统或试剂盒，其中，所述第二Cas蛋白与所述第一Cas蛋白不同；并且，所述系统或试剂盒还包含：(6)所述第二Cas蛋白或含有编码所述第二Cas蛋白的核苷酸序列的核酸分子A2，其中，所述第二Cas蛋白能够切割或断裂第二双链靶核酸；优选地，所述第二Cas蛋白能够断裂第二双链靶核酸，并产生粘末端或平末端；优选地，所述第二Cas蛋白选自Cas9蛋白、Cas12a蛋白、cas12b蛋白、cas12c蛋白、cas12d蛋白、cas12e蛋白、cas12f蛋白、cas12g蛋白、cas12h蛋白、cas12i蛋白、cas14蛋白、Cas13a蛋白、Cas1蛋白、Cas1B蛋白、Cas2蛋白、Cas3蛋白、Cas4蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas7蛋白、Cas8蛋白、Cas10蛋白、Csy1蛋白、Csy2蛋白、Csy3蛋白、Cse1蛋白、Cse2蛋白、Csc1蛋白、Csc2蛋白、Csa5蛋白、Csn2蛋白、Csm2蛋白、Csm3蛋白、Csm4蛋白、Csm5蛋白、Csm6蛋白、Cmr1蛋白、Cmr3蛋白、Cmr4蛋白、Cmr5蛋白、Cmr6蛋白、Csb1蛋白、Csb2蛋白、Csb3蛋白、Csx17蛋白、Csx14蛋白、Csx10蛋白、Csx16蛋白、CsaX蛋白、Csx3蛋白、Csx1蛋白、Csx15蛋白、Csf1蛋白、Csf2蛋白、Csf3蛋白、Csf4蛋白及其同源物或其修饰形式；优选地，所述第二Cas蛋白为Cas9蛋白，例如酿脓链球菌(S.pyogenes)的Cas9蛋白(spCas9)；优选地，所述第二Cas蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；优选地，所述核酸分子A2能够在细胞中表达所述第二Cas蛋白；优选地，所述核酸分子A2包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分
子A2为含有编码所述第二Cas蛋白的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)。12.权利要求1
‑
11任一项的系统或试剂盒，其中，所述系统或试剂盒还包含：(7)第二标签引物或含有编码所述第二标签引物的核苷酸序列的核酸分子D2，其中，所述第二标签引物含有第二标签序列和第二靶结合序列，所述第二标签序列位于所述第二靶结合序列的上游或5
’
端；并且，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第二靶结合序列能够杂交或退火到所述断裂的靶核酸片段的一条核酸链的3
’
端，形成双链结构，且，所述第二标签序列不与所述靶核酸片段结合，处于游离的单链状态；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第二靶结合序列能够杂交或退火到所述断裂的靶核酸片段的一条核酸链的3
’
端，并且所述3
’
端是因所述第二功能性复合物断裂第二双链靶核酸而形成的；优选地，所述第二靶结合序列的长度为至少5nt，例如5
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10nt，10
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15nt，15
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20nt，20
‑
25nt，25
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30nt，30
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40nt，40
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50nt，50
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100nt，100
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200nt，或者更长；优选地，所述第二靶结合序列与所述第一靶结合序列不同；优选地，所述第二靶结合序列结合的核酸链与所述第一靶结合序列结合的核酸链是不同的；优选地，所述第二靶结合序列结合的核酸链是所述第一靶结合序列结合的核酸链的相对链；优选地，所述第二标签序列的长度为至少4nt，例如4
‑
10nt，10
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15nt，15
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20nt，20
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25nt，25
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30nt，30
‑
40nt，40
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50nt，50
‑
100nt，100
‑
200nt，或者更长；优选地，所述第二标签序列与所述第一标签序列相同或不同；优选地，所述第二标签序列与所述第一标签序列不同；优选地，在所述第二靶结合序列杂交或退火到所述断裂的靶核酸片段的一条核酸链的3
’
端后，第二DNA聚合酶能够以第二标签引物为模板，延伸所述核酸链的3
’
端；优选地，所述延伸形成第二悬突；优选地，所述第二DNA聚合酶与所述第一DNA聚合酶相同或者不同；优选地，所述第二DNA聚合酶与所述第一DNA聚合酶相同；优选地，所述第二标签引物为单链脱氧核糖核酸或者单链核糖核酸；优选地，所述第二标签引物为单链核糖核酸，并且所述第二DNA聚合酶为依赖于RNA的DNA聚合酶；或者，所述第二标签引物为单链脱氧核糖核酸，并且所述第二DNA聚合酶为依赖于DNA的DNA聚合酶；优选地，所述第二引导序列结合的核酸链与所述第二靶结合序列结合的核酸链是不同的；优选地，所述第二引导序列结合的核酸链是所述第二靶结合序列结合的核酸链的相对链；优选地，所述第二引导序列与所述第一靶结合序列结合相同的核酸链，并且，所述第二引导序列的结合位置位于所述第一靶结合序列的结合位置的上游或5
’
端；优选地，所述第一引导序列与所述第二靶结合序列结合相同的核酸链，并且，所述第一引导序列的结合位置位于所述第二靶结合序列的结合位置的上游或5
’
端；优选地，所述第一悬突和第二悬突包含于相同的靶核酸片段上，且彼此位于相对的核酸链上；优选地，所述核酸分子D2能够在细胞中转录出所述第二标签引物；优选地，所述核酸分子D2包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分
子D2为含有编码所述第二标签引物的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)。13.权利要求12的系统或试剂盒，其中，所述第二DNA聚合酶与所述第一DNA聚合酶不同；并且，所述系统或试剂盒还包含：(8)所述第二DNA聚合酶或含有编码所述第二DNA聚合酶的核苷酸序列的核酸分子B2；优选地，所述第二DNA聚合酶选自依赖于DNA的DNA聚合酶和依赖于RNA的DNA聚合酶；优选地，所述第二DNA聚合酶为依赖于RNA的DNA聚合酶；优选地，所述第二DNA聚合酶为逆转录酶，例如来自莫洛尼氏鼠白血病病毒人免疫缺陷病毒(HIV)，禽肉瘤
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白血病病毒(ASLV)，Rous肉瘤病毒(RSV)，禽成髓细胞增多症病毒(AMV)，禽成红细胞增多症病毒辅助病毒，禽粒细胞瘤病毒MC29辅助病毒，禽网状内皮组织增生病毒辅助病毒，禽肉瘤病毒UR2辅助病毒，禽肉瘤病毒Y73辅助病毒，Rous相关病毒和成髓细胞增多相关病毒(MAV)的逆转录酶；优选地，所述第二DNA聚合酶具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；优选地，所述核酸分子B2能够在细胞中表达所述第二DNA聚合酶；优选地，所述核酸分子B2包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分子B2为含有编码所述第二DNA聚合酶的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)。14.权利要求12或13的系统或试剂盒，其中，所述第二标签引物与所述第二gRNA相连接；优选地，所述第二标签引物通过接头或者不通过接头与所述第二gRNA共价相连接；优选地，所述第二标签引物任选地通过接头连接至所述第二gRNA的3
’
端；优选地，所述接头为核酸接头(例如核糖核酸接头或脱氧核糖核酸接头)；优选地，所述第二标签引物为单链核糖核酸，并且，其通过核糖核酸接头或者不通过核糖核酸接头与所述第二gRNA的3
’
端相连接，形成第二PegRNA；优选地，所述核酸分子C2和核酸分子D2包含于相同的表达载体(例如，真核表达载体)中；优选地，所述核酸分子C2和核酸分子D2在细胞中能够转录出含有所述第二gRNA和所述第二标签引物的第二PegRNA；优选地，所述系统或试剂盒包含：含有所述第二gRNA和所述第二标签引物的第二PegRNA，或者，含有编码所述第二PegRNA的核苷酸序列的核酸分子。15.权利要求13或14的系统或试剂盒，其中，所述第二Cas蛋白与所述第二DNA聚合酶是分离的或者相连接的；优选地，所述第二Cas蛋白通过接头或者不通过接头与所述第二DNA聚合酶共价相连接；优选地，所述接头为肽接头，例如柔性肽接头；例如，所述接头具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；优选地，所述第二Cas蛋白通过肽接头或者不通过肽接头与所述第二DNA聚合酶融合，形成第二融合蛋白；优选地，所述第二Cas蛋白任选地通过接头连接或融合至所述第二DNA聚合酶的N端；或者，所述第二Cas蛋白任选地通过接头连接或融合至所述第二DNA聚合酶的C端；优选地，所述第二融合蛋白具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；优选地，所述核酸分子A2和核酸分子B2包含于相同或不同的表达载体(例如，真核表达
载体)中；优选地，所述核酸分子A2和核酸分子B2在细胞中能够表达分离的所述第二Cas蛋白和所述第二DNA聚合酶，或者能够表达含有所述第二Cas蛋白和所述第二DNA聚合酶的第二融合蛋白；优选地，所述系统或试剂盒包含，含有所述第二Cas蛋白和所述第二DNA聚合酶的第二融合蛋白，或者，含有编码所述第二融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；或者，分离的所述第二Cas蛋白和第二DNA聚合酶，或者，能够表达分离的所述第二Cas蛋白和第二DNA聚合酶的核酸分子；优选地，所述第一和第二Cas蛋白是相同的Cas蛋白，所述第一和第二DNA聚合酶是相同的DNA聚合酶；并且，所述系统或试剂盒包含：(M1
‑
1)含有所述第一Cas蛋白和所述第一DNA聚合酶的第一融合蛋白，或者，含有编码所述第一融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；或，(M1
‑
2)分离的所述第一Cas蛋白和第一DNA聚合酶，或者，能够表达分离的所述第一Cas蛋白和第一DNA聚合酶的核酸分子；(M2)含有所述第一gRNA和第一标签引物的第一PegRNA，或者，含有编码所述第一PegRNA的核苷酸序列的核酸分子；(M3)含有所述第二gRNA和第二标签引物的第二PegRNA，或者，含有编码所述第二PegRNA的核苷酸序列的核酸分子。16.权利要求1
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15任一项的系统或试剂盒，其中，所述系统或试剂盒还包含核酸载体；优选地，所述核酸载体是双链的；优选地，所述核酸载体是环状双链载体；优选地，所述核酸载体包含能够与所述第一引导序列杂交或退火的第一引导结合序列(例如，所述第一引导序列的互补序列)，和/或，能够与所述第二引导序列杂交或退火的第二引导结合序列(例如，所述第二引导序列的互补序列)；任选地，所述核酸载体在所述第一引导结合序列与所述第二引导结合序列之间还包含限制性酶切位点；优选地，所述第一引导结合序列与所述第二引导结合序列位于所述核酸载体的相对链上；优选地，所述核酸载体还包含所述第一Cas蛋白识别的第一PAM序列，和/或，所述第二Cas蛋白识别的第二PAM序列；优选地，所述第一功能性复合物能够通过所述第一引导结合序列和所述第一PAM序列，结合并断裂所述核酸载体；和/或，所述第二功能性复合物能够通过所述第二引导结合序列和所述第二PAM序列，结合并断裂所述核酸载体。17.权利要求16的系统或试剂盒，其中，所述核酸载体还包含目的基因；优选地，所述目的基因位于所述第一引导结合序列与所述第二引导结合序列之间；优选地，所述第一功能性复合物和所述第二功能性复合物断裂所述核酸载体，导致产生含有目的基因的核酸片段；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一标签引物能够通过所述第一靶结合序列与所述核酸片段的一条核酸链的3
’
端杂交或退火，形成双链结构，并且，所述第一标签引物的所述第一标签序列处于游离状态；优选地，所述第一靶结合序列杂交或退火的核酸链是含有所述第一引导结合序列的核酸链的相对链；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第二标签引物能够通过所述第二靶结
合序列与所述核酸片段的一条核酸链的3
’
端杂交或退火，形成双链结构，并且，所述第二标签引物的所述第二标签序列处于游离状态；优选地，所述第二靶结合序列杂交或退火的核酸链是含有所述第二引导结合序列的核酸链的相对链；优选地，所述第一靶结合序列杂交或退火的核酸链是所述第二靶结合序列杂交或退火的核酸链的相对链。18.权利要求16或17的系统或试剂盒，其中，所述核酸载体还包含第一靶序列；其中，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一标签引物能够通过所述第一靶结合序列与所述第一靶序列杂交或退火，形成双链结构，并且，所述第一标签引物的所述第一标签序列处于游离状态；优选地，所述第一靶序列位于所述第一引导结合序列与所述第二引导结合序列之间；优选地，所述第一靶序列位于所述第一引导结合序列的相对链；优选地，在所述第一功能性复合物断裂所述核酸载体后，含有第一靶序列的核酸链能够以退火至第一靶序列的第一标签引物为模板进行延伸(优选地，形成第一悬突)；优选地，所述第一功能性复合物断裂所述核酸载体的位点位于所述第一靶序列的3
’
末端或者3
’
部分；优选地，所述第一靶序列位于所述含有目的基因的核酸片段的一条核酸链的3
’
末端；和/或，所述核酸载体还包含第二靶序列；其中，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第二标签引物能够通过所述第二靶结合序列与所述第二靶序列杂交或退火，形成双链结构，并且，所述第二标签引物的所述第二标签序列处于游离状态；优选地，所述第二靶序列位于所述第一引导结合序列与所述第二引导结合序列之间；优选地，所述第二靶序列位于所述第二引导结合序列的相对链；优选地，在所述第二功能性复合物断裂所述核酸载体后，含有第二靶序列的核酸链能够以退火至第二靶序列的第二标签引物为模板进行延伸(优选地，形成第二悬突)；优选地，所述第二功能性复合物断裂所述核酸载体的位点位于所述第二靶序列的3
’
末端或者3
’
部分；优选地，所述第二靶序列位于所述含有目的基因的核酸片段的一条核酸链的3
’
末端；优选地，含有第一靶序列的核酸链位于含有第二靶序列的核酸链的相对链；优选地，所述核酸载体在所述第一靶序列与所述第二靶序列之间还包含限制性酶切位点；优选地，所述核酸载体在所述第一靶序列与所述第二靶序列之间还包含目的基因。19.权利要求1
‑
18任一项的系统或试剂盒，其中，所述系统或试剂盒还包含：(9)第三gRNA或含有编码所述第三gRNA的核苷酸序列的核酸分子C3，其中，所述第三gRNA能够与第三Cas蛋白结合，并形成第三功能性复合物；所述第三功能性复合物能够将第三双链靶核酸的两条链断裂，形成断裂的核苷酸片段a1和a2；优选地，所述第三Cas蛋白与所述第一Cas蛋白或第二Cas蛋白相同或者不同；优选地，所述第一、第二和第三Cas蛋白是相同的Cas蛋白；优选地，所述第三gRNA含有第三引导序列，并且，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第三引导序列能够杂交或退火到第三双链靶核酸的一条核酸链；优选地，所述第三功能性复合物在所述第三引导序列与第三双链靶核酸结合后，将第三双链靶核酸的两条链断裂；优选地，所述第三引导序列与所述第一引导序列或第二引导序列相同或者不同；优选
地，所述第一、第二和第三引导序列彼此不同；优选地，所述第三双链靶核酸与所述第一双链靶核酸或第二双链靶核酸相同或者不同；优选地，所述第二双链靶核酸与所述第一双链靶核酸是相同的，并且，所述第三双链靶核酸与所述第一和第二双链靶核酸是不同的；优选地，所述第三双链靶核酸为基因组DNA；优选地，所述第三引导序列的长度为至少5nt，例如5
‑
10nt，10
‑
15nt，15
‑
20nt，20
‑
25nt，25
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
100nt，100
‑
200nt，或者更长；优选地，所述第三gRNA还含有第三支架序列，其能够被所述第三Cas蛋白识别并结合，从而形成第三功能性复合物；优选地，所述第三支架序列的长度为至少20nt，例如20
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
100nt，100
‑
200nt，或者更长；优选地，所述第三支架序列与所述第一支架序列或第二支架序列相同或者不同；优选地，所述第一、第二和第三支架序列是相同的；优选地，所述第三引导序列位于所述第三支架序列的上游或5
’
端；优选地，所述核酸分子C3能够在细胞中转录出所述第三gRNA；优选地，所述核酸分子C3包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分子C3为含有编码所述第三gRNA的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)。20.权利要求19的系统或试剂盒，其中，所述第三功能性复合物能够将第三双链靶核酸的两条链断裂，形成断裂的核苷酸片段a1和a2；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一标签序列或其互补序列或所述第一悬突能够与断裂的核苷酸片段a1杂交或退火；优选地，所述第一标签序列或其互补序列或所述第一悬突能够在第三功能性复合物断裂第三双链靶核酸所形成的末端处与断裂的核苷酸片段a1杂交或退火；优选地，所述第一标签序列的互补序列或所述第一悬突能够杂交或退火到断裂的核苷酸片段a1的一条核酸链的3
’
端或3
’
部分，并且所述3
’
端或3
’
部分是因所述第三功能性复合物断裂所述第三双链靶核酸而形成的；优选地，所述第一标签序列的互补序列或所述第一悬突能够杂交或退火到断裂的核苷酸片段a1的一条核酸链的3
’
部分，且所述核苷酸片段a1的3
’
部分与所述第三双链靶核酸所形成的断裂末端之间具有第一间隔区域；优选地，所述第一间隔区域的长度为1nt
‑
200nt，例如1
‑
10nt，10
‑
20nt，20
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
100nt或100
‑
200nt；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第二标签序列或其互补序列或所述第二悬突能够与断裂的核苷酸片段a2杂交或退火；优选地，所述第二标签序列或其互补序列或所述第二悬突能够在第三功能性复合物断裂第三双链靶核酸所形成的末端处与断裂的核苷酸片段a2杂交或退火；优选地，所述第二标签序列的互补序列或所述第二悬突能够杂交或退火到断裂的核苷酸片段a2的一条核酸链的3
’
端或3
’
部分，并且所述3
’
端或3
’
部分是因所述第三功能性复合物断裂所述第三双链靶核酸而形成的；优选地，所述第二标签序列的互补序列或所述第二悬突能够杂交或退火到断裂的核苷酸片段a2的一条核酸链的3
’
部分，且所述核苷酸片段a2的3
’
部分与所述第三双链靶核酸所
形成的断裂末端之间具有第二间隔区域。优选地，所述第二间隔区域的长度为1nt
‑
200nt，例如1
‑
10nt，10
‑
20nt，20
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
100nt或100
‑
200nt。21.权利要求19或20的系统或试剂盒，其中，所述第三Cas蛋白与所述第一Cas蛋白或第二Cas蛋白不同；并且，所述系统或试剂盒还包含：(10)所述第三Cas蛋白或含有编码所述第三Cas蛋白的核苷酸序列的核酸分子A3，其中，所述第三Cas蛋白能够切割或断裂第三双链靶核酸；优选地，所述第三Cas蛋白选自Cas9蛋白、Cas12a蛋白、cas12b蛋白、cas12c蛋白、cas12d蛋白、cas12e蛋白、cas12f蛋白、cas12g蛋白、cas12h蛋白、cas12i蛋白、cas14蛋白、Cas13a蛋白，Cas1蛋白、Cas1B蛋白、Cas2蛋白、Cas3蛋白、Cas4蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas7蛋白、Cas8蛋白、Cas10蛋白、Csy1蛋白、Csy2蛋白、Csy3蛋白、Cse1蛋白、Cse2蛋白、Csc1蛋白、Csc2蛋白、Csa5蛋白、Csn2蛋白、Csm2蛋白、Csm3蛋白、Csm4蛋白、Csm5蛋白、Csm6蛋白、Cmr1蛋白、Cmr3蛋白、Cmr4蛋白、Cmr5蛋白、Cmr6蛋白、Csb1蛋白、Csb2蛋白、Csb3蛋白、Csx17蛋白、Csx14蛋白、Csx10蛋白、Csx16蛋白、CsaX蛋白、Csx3蛋白、Csx1蛋白、Csx15蛋白、Csf1蛋白、Csf2蛋白、Csf3蛋白、Csf4蛋白及其同源物或其修饰形式；优选地，所述第三Cas蛋白能够断裂第三双链靶核酸，并产生粘末端或平末端；优选地，所述第三Cas蛋白为Cas9蛋白，例如酿脓链球菌(S.pyogenes)的Cas9蛋白(spCas9)；优选地，所述第三Cas蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；优选地，所述核酸分子A3能够在细胞中表达所述第三Cas蛋白；优选地，所述核酸分子A3包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分子A3为含有编码所述第三Cas蛋白的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)。22.权利要求19或20的系统或试剂盒，其中，所述第一、第二和第三Cas蛋白是相同的Cas蛋白，所述第一和第二DNA聚合酶是相同的DNA聚合酶；并且，所述系统或试剂盒包含：(M1
‑
1)含有所述第一Cas蛋白和所述第一DNA聚合酶的第一融合蛋白，或者，含有编码所述第一融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；或，(M1
‑
2)分离的所述第一Cas蛋白和第一DNA聚合酶，或者，能够表达分离的所述第一Cas蛋白和第一DNA聚合酶的核酸分子；(M2)含有所述第一gRNA和第一标签引物的第一PegRNA，或者，含有编码所述第一PegRNA的核苷酸序列的核酸分子；(M3)含有所述第二gRNA和第二标签引物的第二PegRNA，或者，含有编码所述第二PegRNA的核苷酸序列的核酸分子；(M4)所述第三gRNA或含有编码所述第三gRNA的核苷酸序列的核酸分子；优选地，所述系统或试剂盒还包含：权利要求16
‑
18任一项中所定义的核酸载体。23.权利要求19
‑
22任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述系统或试剂盒还包含：(11)第三标签引物或含有编码所述第三标签引物的核苷酸序列的核酸分子D3，其中，所述第三标签引物含有第三标签序列和第三靶结合序列，所述第三标签序列位于所述第三靶结合序列的上游或5
’
端；并且，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第三靶结合序列能够杂交或退火到所述断裂的核苷酸片段a1或a2的一条核酸链的3
’
端，形成双链结构，且，所述第三标签序列不与所述核苷酸片段a1或a2结合，处于游离的单链状态；
优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第三靶结合序列能够杂交或退火到所述断裂的核苷酸片段a1或a2的一条核酸链的3
’
端，并且所述3
’
端是因所述第三功能性复合物断裂第三双链靶核酸而形成的；优选地，所述第三靶结合序列结合的核酸链与所述第三引导序列结合的核酸链是不同的；优选地，所述第三靶结合序列结合的核酸链是所述第三引导序列结合的核酸链的相对链；优选地，所述第三靶结合序列的长度为至少5nt，例如5
‑
10nt，10
‑
15nt，15
‑
20nt，20
‑
25nt，25
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
100nt，100
‑
200nt，或者更长；优选地，所述第三靶结合序列与所述第一或第二靶结合序列不同；优选地，在所述第三靶结合序列杂交或退火到所述断裂的核苷酸片段a1或a2的一条核酸链的3
’
端后，第三DNA聚合酶能够以第三标签引物为模板，延伸所述核酸链的3
’
端；优选地，所述延伸形成第三悬突；优选地，所述第三标签序列的长度为至少4nt，例如4
‑
10nt，10
‑
15nt，15
‑
20nt，20
‑
25nt，25
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
100nt，100
‑
200nt，或者更长；优选地，所述第三标签序列与所述第一或第二标签序列相同或不同；优选地，所述第三标签序列与所述第一或第二标签序列不同；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第三标签序列的互补序列或所述第三悬突能够与含有第一悬突或者第二悬突的核酸链杂交或退火；优选地，所述第三标签序列的互补序列或所述第三悬突与所述第一悬突或者第二悬突或其上游核苷酸序列杂交或退火；优选地，所述第三DNA聚合酶与所述第一或第二DNA聚合酶相同或者不同；优选地，所述第一、第二和第三DNA聚合酶是相同的DNA聚合酶；优选地，所述第三标签引物为单链脱氧核糖核酸或者单链核糖核酸；优选地，所述第三标签引物为单链核糖核酸，并且所述第三DNA聚合酶为依赖于RNA的DNA聚合酶；或者，所述第三标签引物为单链脱氧核糖核酸，并且所述第三DNA聚合酶为依赖于DNA的DNA聚合酶；优选地，所述核酸分子D3能够在细胞中转录出所述第三标签引物；优选地，所述核酸分子D3包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分子D3为含有编码所述第三标签引物的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)。24.权利要求23所述的系统或试剂盒，其中，所述第三DNA聚合酶与所述第一或第二DNA聚合酶不同；并且，所述系统或试剂盒还包含：(12)所述第三DNA聚合酶或含有编码所述第三DNA聚合酶的核苷酸序列的核酸分子B3；优选地，所述第三DNA聚合酶选自依赖于DNA的DNA聚合酶和依赖于RNA的DNA聚合酶；优选地，所述第三DNA聚合酶为依赖于RNA的DNA聚合酶；优选地，所述第三DNA聚合酶为逆转录酶，例如来自莫洛尼氏鼠白血病病毒人免疫缺陷病毒(HIV)，禽肉瘤
‑
白血病病毒(ASLV)，Rous肉瘤病毒(RSV)，禽成髓细胞增多症病毒(AMV)，禽成红细胞增多症病毒辅助病毒，禽粒细胞瘤病毒MC29辅助病毒，禽网状内皮组织增生病毒辅助病毒，禽肉瘤病毒UR2辅助病毒，禽肉瘤病毒Y73辅助病毒，Rous相关病毒和成髓细胞增多相关病毒(MAV)的逆转录酶；
优选地，所述第三DNA聚合酶具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；优选地，所述核酸分子B3能够在细胞中表达所述第三DNA聚合酶；优选地，所述核酸分子B3包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分子B3为含有编码所述第三DNA聚合酶的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)。25.权利要求23或24的系统或试剂盒，其中，所述第三标签引物与所述第三gRNA相连接；优选地，所述第三标签引物通过接头或者不通过接头与所述第三gRNA共价相连接；优选地，所述第三标签引物任选地通过接头连接至所述第三gRNA的3
’
端；优选地，所述接头为核酸接头(例如核糖核酸接头或脱氧核糖核酸接头)；优选地，所述第三标签引物为单链核糖核酸，并且，其通过核糖核酸接头或者不通过核糖核酸接头与所述第三gRNA的3
’
端相连接，形成第三PegRNA；优选地，所述核酸分子C3和核酸分子D3包含于相同的表达载体(例如，真核表达载体)中；优选地，所述核酸分子C3和核酸分子D3在细胞中能够转录出含有所述第三gRNA和所述第三标签引物的第三PegRNA；优选地，所述系统或试剂盒包含：含有所述第三gRNA和所述第三标签引物的第三PegRNA，或者，含有编码所述第三PegRNA的核苷酸序列的核酸分子。26.权利要求24或25的系统或试剂盒，其中，所述第三Cas蛋白与所述第三DNA聚合酶是分离的或者相连接的；优选地，所述第三Cas蛋白通过接头或者不通过接头与所述第三DNA聚合酶共价相连接；优选地，所述接头为肽接头，例如柔性肽接头；例如，所述接头具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；优选地，所述第三Cas蛋白通过肽接头或者不通过肽接头与所述第三DNA聚合酶融合，形成第三融合蛋白；优选地，所述第三Cas蛋白任选地通过接头连接或融合至所述第三DNA聚合酶的N端；或者，所述第三Cas蛋白任选地通过接头连接或融合至所述第三DNA聚合酶的C端；优选地，所述第三融合蛋白具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；优选地，所述核酸分子A3和核酸分子B3包含于相同或不同的表达载体(例如，真核表达载体)中；优选地，所述核酸分子A3和核酸分子B3在细胞中能够表达分离的所述第三Cas蛋白和所述第三DNA聚合酶，或者能够表达含有所述第三Cas蛋白和所述第三DNA聚合酶的第三融合蛋白；优选地，所述系统或试剂盒包含，含有所述第三Cas蛋白和所述第三DNA聚合酶的第三融合蛋白，或者，含有编码所述第三融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；或者，分离的所述第三Cas蛋白和第三DNA聚合酶，或者，能够表达分离的所述第三Cas蛋白和第三DNA聚合酶的核酸分子。27.权利要求23或25的系统或试剂盒，其中，所述第一、第二和第三Cas蛋白是相同的Cas蛋白，所述第一、第二和第三DNA聚合酶是相同的DNA聚合酶；并且，所述系统或试剂盒包含：(M1
‑
1)含有所述第一Cas蛋白和所述第一DNA聚合酶的第一融合蛋白，或者，含有编码
所述第一融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；或，(M1
‑
2)分离的所述第一Cas蛋白和第一DNA聚合酶，或者，能够表达分离的所述第一Cas蛋白和第一DNA聚合酶的核酸分子；(M2)含有所述第一gRNA和第一标签引物的第一PegRNA，或者，含有编码所述第一PegRNA的核苷酸序列的核酸分子；(M3)含有所述第二gRNA和第二标签引物的第二PegRNA，或者，含有编码所述第二PegRNA的核苷酸序列的核酸分子；(M4)含有所述第三gRNA和第三标签引物的第三PegRNA，或者，含有编码所述第三PegRNA的核苷酸序列的核酸分子；优选地，所述系统或试剂盒还包含：权利要求16
‑
18任一项中所定义的核酸载体。28.权利要求1
‑
27任一项的系统或试剂盒，其中，所述系统或试剂盒还包含：(13)第四gRNA或含有编码所述第四gRNA的核苷酸序列的核酸分子C4，其中，所述第四gRNA能够与第四Cas蛋白结合，并形成第四功能性复合物；所述第四功能性复合物能够将第四双链靶核酸的两条链断裂，形成断裂的靶核酸片段b1和b2；优选地，所述第四Cas蛋白与所述第一、第二或第三Cas蛋白相同或者不同；优选地，所述第一、第二、第三和第四Cas蛋白是相同的Cas蛋白；优选地，所述第四gRNA含有第四引导序列，并且，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第四引导序列能够杂交或退火到第四双链靶核酸的一条核酸链；优选地，所述第四功能性复合物在所述第四引导序列与第四双链靶核酸结合后，将第四双链靶核酸的两条链断裂；优选地，所述第四引导序列与所述第一、第二或第三引导序列相同或者不同；优选地，所述第一、第二、第三和第四引导序列彼此不同；优选地，所述第四双链靶核酸与所述第一、第二或第三双链靶核酸相同或者不同；优选地，所述第二双链靶核酸与所述第一双链靶核酸是相同的，并且，所述第四双链靶核酸与所述第三双链靶核酸是相同的，但与第一或第二双链靶核酸不同；优选地，所述第四功能性复合物与所述第三功能性复合物在不同的位置断裂所述相同的双链靶核酸；优选地，所述第四功能性复合物与所述第三功能性复合物断裂相同的双链靶核酸，并且，所述第四引导序列结合的核酸链与所述第三引导序列结合的核酸链是不同的；优选地，所述第四引导序列结合的核酸链是所述第三引导序列结合的核酸链的相对链；优选地，所述第四双链靶核酸为基因组DNA；优选地，所述第四引导序列的长度为至少5nt，例如5
‑
10nt，10
‑
15nt，15
‑
20nt，20
‑
25nt，25
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
100nt，100
‑
200nt，或者更长；优选地，所述第四gRNA还含有第四支架序列，其能够被所述第四Cas蛋白识别并结合，从而形成第四功能性复合物；优选地，所述第四支架序列的长度为至少20nt，例如20
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
100nt，100
‑
200nt，或者更长；优选地，所述第四支架序列与所述第一、第二或第三支架序列相同或者不同；优选地，所述第一、第二、第三和第四支架序列是相同的；优选地，所述第四引导序列位于所述第四支架序列的上游或5
’
端；优选地，所述核酸分子C4能够在细胞中转录出所述第四gRNA；
优选地，所述核酸分子C4包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分子C4为含有编码所述第四gRNA的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)。29.权利要求28的系统或试剂盒，其中，所述第四双链靶核酸与所述第三双链靶核酸是相同的，并且，所述第三和第四功能性复合物在不同的位置断裂所述相同的双链靶核酸，形成断裂的核苷酸片段a1、a2和a3；其中，在断裂之前，在所述相同的双链靶核酸中，核苷酸片段a1、a2和a3依次排列(即，核苷酸片段a1通过核苷酸片段a2与核苷酸片段a3相连)；优选地，所述第三和第四功能性复合物分别导致核苷酸片段a1和a2的分离以及核苷酸片段a2和a3的分离；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一标签序列或其互补序列或所述第一悬突能够与断裂的核苷酸片段a1杂交或退火；优选地，所述第一标签序列或其互补序列或所述第一悬突能够在第三功能性复合物断裂第三双链靶核酸所形成的末端处与断裂的核苷酸片段a1杂交或退火；优选地，所述第一标签序列的互补序列或所述第一悬突能够杂交或退火到断裂的核苷酸片段a1的一条核酸链的3
’
端或3
’
部分，并且所述3
’
端或3
’
部分是因所述第三功能性复合物断裂所述第三双链靶核酸而形成的；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第二标签序列或其互补序列或所述第二悬突能够与断裂的核苷酸片段a3杂交或退火；优选地，所述第二标签序列或其互补序列或所述第二悬突能够在第四功能性复合物断裂第三双链靶核酸所形成的末端处与断裂的核苷酸片段a3杂交或退火；优选地，所述第二标签序列的互补序列或所述第二悬突能够杂交或退火到断裂的核苷酸片段a3的一条核酸链的3
’
端或3
’
部分，并且所述3
’
端或3
’
部分是因所述第四功能性复合物断裂所述第三双链靶核酸而形成的。30.权利要求28或29的系统或试剂盒，其中，所述第四Cas蛋白与所述第一、第二或第三Cas蛋白不同；并且，所述系统或试剂盒还包含：(14)所述第四Cas蛋白或含有编码所述第四Cas蛋白的核苷酸序列的核酸分子A4，其中，所述第四Cas蛋白能够切割或断裂第四双链靶核酸；优选地，所述第四Cas蛋白选自Cas9蛋白、Cas12a蛋白、cas12b蛋白、cas12c蛋白、cas12d蛋白、cas12e蛋白、cas12f蛋白、cas12g蛋白、cas12h蛋白、cas12i蛋白、cas14蛋白、Cas13a蛋白，Cas1蛋白、Cas1B蛋白、Cas2蛋白、Cas3蛋白、Cas4蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas7蛋白、Cas8蛋白、Cas10蛋白、Csy1蛋白、Csy2蛋白、Csy3蛋白、Cse1蛋白、Cse2蛋白、Csc1蛋白、Csc2蛋白、Csa5蛋白、Csn2蛋白、Csm2蛋白、Csm3蛋白、Csm4蛋白、Csm5蛋白、Csm6蛋白、Cmr1蛋白、Cmr3蛋白、Cmr4蛋白、Cmr5蛋白、Cmr6蛋白、Csb1蛋白、Csb2蛋白、Csb3蛋白、Csx17蛋白、Csx14蛋白、Csx10蛋白、Csx16蛋白、CsaX蛋白、Csx3蛋白、Csx1蛋白、Csx15蛋白、Csf1蛋白、Csf2蛋白、Csf3蛋白、Csf4蛋白及其同源物或其修饰形式；优选地，所述第四Cas蛋白能够断裂第四双链靶核酸，并产生粘末端或平末端；优选地，所述第四Cas蛋白为Cas9蛋白，例如酿脓链球菌(S.pyogenes)的Cas9蛋白(spCas9)；优选地，所述第四Cas蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；优选地，所述核酸分子A4能够在细胞中表达所述第四Cas蛋白；优选地，所述核酸分子A4包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分子A4为含有编码所述第四Cas蛋白的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)。
31.权利要求28或29的系统或试剂盒，其中，所述第一、第二、第三和第四Cas蛋白是相同的Cas蛋白，所述第一和第二DNA聚合酶(以及任选的第三DNA聚合酶)是相同的DNA聚合酶；并且，所述系统或试剂盒包含：(M1
‑
1)含有所述第一Cas蛋白和所述第一DNA聚合酶的第一融合蛋白，或者，含有编码所述第一融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；或，(M1
‑
2)分离的所述第一Cas蛋白和第一DNA聚合酶，或者，能够表达分离的所述第一Cas蛋白和第一DNA聚合酶的核酸分子；(M2)含有所述第一gRNA和第一标签引物的第一PegRNA，或者，含有编码所述第一PegRNA的核苷酸序列的核酸分子；(M3)含有所述第二gRNA和第二标签引物的第二PegRNA，或者，含有编码所述第二PegRNA的核苷酸序列的核酸分子；(M4)所述第三gRNA或含有编码所述第三gRNA的核苷酸序列的核酸分子；或者，含有所述第三gRNA和第三标签引物的第三PegRNA，或，含有编码所述第三PegRNA的核苷酸序列的核酸分子；(M5)所述第四gRNA或含有编码所述第四gRNA的核苷酸序列的核酸分子；优选地，所述系统或试剂盒还包含：权利要求16
‑
18任一项中所定义的核酸载体。32.权利要求28
‑
31任一项所述的系统或试剂盒，其中，所述系统或试剂盒还包含：(15)第四标签引物或含有编码所述第四标签引物的核苷酸序列的核酸分子D4，其中，所述第四标签引物含有第四标签序列和第四靶结合序列，所述第四标签序列位于所述第四靶结合序列的上游或5
’
端；并且，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第四靶结合序列能够杂交或退火到所述断裂的靶核酸片段b1或b2的一条核酸链的3
’
端，形成双链结构，且，所述第四标签序列不与所述靶核酸片段b1或b2结合，处于游离的单链状态；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第四靶结合序列能够杂交或退火到所述断裂的靶核酸片段b1或b2的一条核酸链的3
’
端，并且所述3
’
端是因所述第四功能性复合物断裂第四双链靶核酸而形成的；优选地，所述第四靶结合序列结合的核酸链与所述第四引导序列结合的核酸链是不同的；优选地，所述第四靶结合序列结合的核酸链是所述第四引导序列结合的核酸链的相对链；优选地，所述第四靶结合序列的长度为至少5nt，例如5
‑
10nt，10
‑
15nt，15
‑
20nt，20
‑
25nt，25
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
100nt，100
‑
200nt，或者更长；优选地，所述第四靶结合序列与所述第一、第二或第三靶结合序列不同；优选地，所述第四靶结合序列结合的核酸链与所述第三靶结合序列结合的核酸链是不同的；优选地，所述第四靶结合序列结合的核酸链是所述第三靶结合序列结合的核酸链的相对链；优选地，在所述第四靶结合序列杂交或退火到所述断裂的靶核酸片段b1或b2的一条核酸链的3
’
端后，第四DNA聚合酶能够以第四标签引物为模板，延伸所述核酸链的3
’
端；优选地，所述延伸形成第四悬突；优选地，所述第四标签序列的长度为至少4nt，例如4
‑
10nt，10
‑
15nt，15
‑
20nt，20
‑
25nt，25
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
100nt，100
‑
200nt，或者更长；优选地，所述第四标签序列与所述第一、第二或第三标签序列相同或不同；优选地，所述第四标签序列与所述第一、第二或第三标签序列不同；
优选地，所述第四DNA聚合酶与所述第一、第二或第三DNA聚合酶相同或者不同；优选地，所述第一、第二、第三和第四DNA聚合酶是相同的DNA聚合酶；优选地，所述第四标签引物为单链脱氧核糖核酸或者单链核糖核酸；优选地，所述第四标签引物为单链核糖核酸，并且所述第四DNA聚合酶为依赖于RNA的DNA聚合酶；或者，所述第四标签引物为单链脱氧核糖核酸，并且所述第四DNA聚合酶为依赖于DNA的DNA聚合酶；优选地，所述第四引导序列与所述第三靶结合序列结合相同的核酸链，并且，所述第三靶结合序列的结合位置位于所述第四引导序列的结合位置的上游或5
’
端；优选地，所述第三引导序列与所述第四靶结合序列结合相同的核酸链，并且，所述第四靶结合序列的结合位置位于所述第三引导序列的结合位置的上游或5
’
端；优选地，所述第三悬突和第四悬突包含于不同的靶核酸片段上，且优选地，彼此位于相对的核酸链上；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第四标签序列的互补序列或所述第四悬突能够与含有第一悬突或者第二悬突的核酸链杂交或退火；优选地，所述第四标签序列的互补序列或所述第四悬突能够与所述第一悬突或者第二悬突或其上游核苷酸序列杂交或退火；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第三标签序列的互补序列或所述第三悬突能够与所述第一悬突或其上游核苷酸序列杂交或退火，并且，所述第四标签序列的互补序列或所述第四悬突能够与所述第二悬突或其上游核苷酸序列杂交或退火；或者，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第三标签序列的互补序列或所述第三悬突能够与所述第二悬突或其上游核苷酸序列杂交或退火，并且，所述第四标签序列的互补序列或所述第四悬突能够与所述第一悬突或其上游核苷酸序列杂交或退火；优选地，所述核酸分子D4能够在细胞中转录出所述第四标签引物；优选地，所述核酸分子D4包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分子D4为含有编码所述第四标签引物的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)。33.权利要求32所述的系统或试剂盒，其中，所述第四DNA聚合酶与所述第一、第二或第三DNA聚合酶不同；并且，所述系统或试剂盒还包含：(16)所述第四DNA聚合酶或含有编码所述第四DNA聚合酶的核苷酸序列的核酸分子B4；优选地，所述第四DNA聚合酶选自依赖于DNA的DNA聚合酶和依赖于RNA的DNA聚合酶；优选地，所述第四DNA聚合酶为依赖于RNA的DNA聚合酶；优选地，所述第四DNA聚合酶为逆转录酶，例如来自莫洛尼氏鼠白血病病毒人免疫缺陷病毒(HIV)，禽肉瘤
‑
白血病病毒(ASLV)，Rous肉瘤病毒(RSV)，禽成髓细胞增多症病毒(AMV)，禽成红细胞增多症病毒辅助病毒，禽粒细胞瘤病毒MC29辅助病毒，禽网状内皮组织增生病毒辅助病毒，禽肉瘤病毒UR2辅助病毒，禽肉瘤病毒Y73辅助病毒，Rous相关病毒和成髓细胞增多相关病毒(MAV)的逆转录酶；优选地，所述第四DNA聚合酶具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；优选地，所述核酸分子B4能够在细胞中表达所述第四DNA聚合酶；优选地，所述核酸分子B4包含于表达载体(例如，真核表达载体)中，或者，所述核酸分子B4为含有编码所述第四DNA聚合酶的核苷酸序列的表达载体(例如，真核表达载体)。
34.权利要求32或33的系统或试剂盒，其中，所述第四标签引物与所述第四gRNA相连接；优选地，所述第四标签引物通过接头或者不通过接头与所述第四gRNA共价相连接；优选地，所述第四标签引物任选地通过接头连接至所述第四gRNA的3
’
端；优选地，所述接头为核酸接头(例如核糖核酸接头或脱氧核糖核酸接头)；优选地，所述第四标签引物为单链核糖核酸，并且，其通过核糖核酸接头或者不通过核糖核酸接头与所述第四gRNA的3
’
端相连接，形成第四PegRNA；优选地，所述核酸分子C4和核酸分子D4包含于相同的表达载体(例如，真核表达载体)中；优选地，所述核酸分子C4和核酸分子D4在细胞中能够转录出含有所述第四gRNA和所述第四标签引物的第四PegRNA；优选地，所述系统或试剂盒包含：含有所述第四gRNA和所述第四标签引物的第四PegRNA，或者，含有编码所述第四PegRNA的核苷酸序列的核酸分子。35.权利要求33或34的系统或试剂盒，其中，所述第四Cas蛋白与所述第四DNA聚合酶分离的或者相连接的；优选地，所述第四Cas蛋白通过接头或者不通过接头与所述第四DNA聚合酶共价相连接；优选地，所述接头为肽接头，例如柔性肽接头；例如，所述接头具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；优选地，所述第四Cas蛋白通过肽接头或者不通过肽接头与所述第四DNA聚合酶融合，形成第四融合蛋白；优选地，所述第四Cas蛋白任选地通过接头连接或融合至所述第四DNA聚合酶的N端；或者，所述第四Cas蛋白任选地通过接头连接或融合至所述第四DNA聚合酶的C端；优选地，所述第四融合蛋白具有SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；优选地，所述核酸分子A4和核酸分子B4包含于相同或不同的表达载体(例如，真核表达载体)中；优选地，所述核酸分子A4和核酸分子B4在细胞中能够表达分离的所述第四Cas蛋白和所述第四DNA聚合酶，或者能够表达含有所述第四Cas蛋白和所述第四DNA聚合酶的第四融合蛋白；优选地，所述系统或试剂盒包含，含有所述第四Cas蛋白和所述第四DNA聚合酶的第四融合蛋白，或者，含有编码所述第四融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；或者，分离的所述第四Cas蛋白和第四DNA聚合酶，或者，能够表达分离的所述第四Cas蛋白和第四DNA聚合酶的核酸分子。36.权利要求32或34的系统或试剂盒，其中，所述第一、第二、第三和第四Cas蛋白是相同的Cas蛋白，所述第一、第二、第三和第四DNA聚合酶是相同的DNA聚合酶；并且，所述系统或试剂盒包含：(M1
‑
1)含有所述第一Cas蛋白和所述第一DNA聚合酶的第一融合蛋白，或者，含有编码所述第一融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；或，(M1
‑
2)分离的所述第一Cas蛋白和第一DNA聚合酶，或者，能够表达分离的所述第一Cas蛋白和第一DNA聚合酶的核酸分子；(M2)含有所述第一gRNA和第一标签引物的第一PegRNA，或者，含有编码所述第一PegRNA的核苷酸序列的核酸分子；
(M3)含有所述第二gRNA和第二标签引物的第二PegRNA，或者，含有编码所述第二PegRNA的核苷酸序列的核酸分子；(M4)含有所述第三gRNA和第三标签引物的第三PegRNA，或者，含有编码所述第三PegRNA的核苷酸序列的核酸分子；(M5)含有所述第四gRNA和第四标签引物的第四PegRNA，或者，含有编码所述第四PegRNA的核苷酸序列的核酸分子；优选地，所述系统或试剂盒还包含：权利要求16
‑
18任一项中所定义的核酸载体。37.权利要求32
‑
36任一项的系统或试剂盒，其中，所述第四双链靶核酸与所述第三双链靶核酸是相同的，并且，所述第三和第四功能性复合物在不同的位置断裂所述相同的双链靶核酸，形成断裂的核苷酸片段a1、a2和a3；其中，在所述相同的双链靶核酸中，核苷酸片段a1通过核苷酸片段a2与核苷酸片段a3相连；优选地，所述第三和第四功能性复合物分别导致核苷酸片段a1和a2的分离以及核苷酸片段a2和a3的分离；优选地，所述核苷酸片段a1具有以第三标签引物为模板延伸形成的第三悬突；并且，所述核苷酸片段a3具有以第四标签引物为模板延伸形成的第四悬突；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一标签序列或其互补序列或所述第一悬突能够与断裂的核苷酸片段a1杂交或退火；优选地，所述第一标签序列或其互补序列或所述第一悬突能够在第三功能性复合物断裂第三双链靶核酸所形成的末端处与断裂的核苷酸片段a1杂交或退火；优选地，所述第一标签序列的互补序列或所述第一悬突能够杂交或退火到断裂的核苷酸片段a1的一条核酸链的3
’
端或3
’
部分，并且所述3
’
端或3
’
部分是因所述第三功能性复合物断裂所述第三双链靶核酸而形成的；优选地，所述第一悬突能够杂交或退火到断裂的核苷酸片段a1的第三悬突或其上游核苷酸序列；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第三标签序列的互补序列或所述第三悬突能够与所述第一悬突或其上游核苷酸序列杂交或退火；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第二标签序列或其互补序列或所述第二悬突能够与断裂的核苷酸片段a3杂交或退火；优选地，所述第二标签序列或其互补序列或所述第二悬突能够在第四功能性复合物断裂第三双链靶核酸所形成的末端处与断裂的核苷酸片段a3杂交或退火；优选地，所述第二标签序列的互补序列或所述第二悬突能够杂交或退火到断裂的核苷酸片段a3的一条核酸链的3
’
端或3
’
部分，并且所述3
’
端或3
’
部分是因所述第四功能性复合物断裂所述第三双链靶核酸而形成的；优选地，所述第二悬突能够杂交或退火到断裂的核苷酸片段a3的第四悬突或其上游核苷酸序列；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第四标签序列的互补序列或所述第四悬突能够与所述第二悬突或其上游核苷酸序列杂交或退火。38.权利要求1
‑
37任一项的系统或试剂盒，所述试剂盒还包含额外的组分；优选地，所述额外的组分包括选自下列的一项或多项：(1)一个或多个(例如，2个，3个，4个，5个，10个，15个，20个，或更多个)额外的gRNA或含有编码所述额外的gRNA的核苷酸序列的核酸分子，其中，所述额外的gRNA能够与Cas蛋白结合，并形成功能性复合物；优选地，所述功能性复合物能够将双链靶核酸的两条链断裂，形成断裂的靶核酸片段；
(2)一个或多个(例如，2个，3个，4个，5个，10个，15个，20个，或更多个)额外的Cas蛋白或含有编码所述额外的Cas蛋白的核苷酸序列的核酸分子；优选地，所述Cas蛋白能够切割或断裂双链靶核酸；(3)一个或多个(例如，2个，3个，4个，5个，10个，15个，20个，或更多个)额外的标签引物或含有编码所述额外的标签引物的核苷酸序列的核酸分子，其中，所述额外的标签引物含有标签序列和靶结合序列，所述标签序列位于所述靶结合序列的上游或5
’
端；优选地，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述靶结合序列能够杂交或退火到所述断裂的靶核酸片段的一条核酸链的3
’
端，形成双链结构，且，所述标签序列不与所述靶核酸片段结合，处于游离的单链状态；(4)一个或多个(例如，2个，3个，4个，5个，10个，15个，20个，或更多个)额外的DNA聚合酶或含有编码所述额外的DNA聚合酶的核苷酸序列的核酸分子；优选地，所述额外的DNA聚合酶选自依赖于DNA的DNA聚合酶和依赖于RNA的DNA聚合酶；优选地，所述额外的DNA聚合酶为依赖于RNA的DNA聚合酶，例如逆转录酶。39.一种融合蛋白，其包含Cas蛋白与依赖于模板的DNA聚合酶，其中，所述Cas蛋白能够断裂双链靶核酸；优选地，所述Cas蛋白能够断裂双链靶核酸，并产生粘末端或平末端；优选地，所述Cas蛋白选自Cas9蛋白、Cas12a蛋白、cas12b蛋白、cas12c蛋白、cas12d蛋白、cas12e蛋白、cas12f蛋白、cas12g蛋白、cas12h蛋白、cas12i蛋白、cas14蛋白、Cas13a蛋白、Cas1蛋白、Cas1B蛋白、Cas2蛋白、Cas3蛋白、Cas4蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas7蛋白、Cas8蛋白、Cas10蛋白、Csy1蛋白、Csy2蛋白、Csy3蛋白、Cse1蛋白、Cse2蛋白、Csc1蛋白、Csc2蛋白、Csa5蛋白、Csn2蛋白、Csm2蛋白、Csm3蛋白、Csm4蛋白、Csm5蛋白、Csm6蛋白、Cmr1蛋白、Cmr3蛋白、Cmr4蛋白、Cmr5蛋白、Cmr6蛋白、Csb1蛋白、Csb2蛋白、Csb3蛋白、Csx17蛋白、Csx14蛋白、Csx10蛋白、Csx16蛋白、CsaX蛋白、Csx3蛋白、Csx1蛋白、Csx15蛋白、Csf1蛋白、Csf2蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，周琪，王晨鑫，方森，焦贯怡，
申请(专利权)人：北京干细胞与再生医学研究院，
类型：发明
国别省市：