【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫细胞治疗领域，涉及一种双靶向嵌合抗原受体，具体涉及靶向cd33和mesothelin双靶点的嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
1、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)技术的运用极大提高了免疫细胞治疗肿瘤的精准性及有效性，代表性的案例是在t细胞中表达car元件，表达car的t细胞称为chimeric antigen receptor t(car-t)，能够靶向杀伤表达目标抗原的细胞。同样，car元件还可以在nk细胞中表达，制备成car-nk细胞，也能够靶向表达目标抗原的细胞。这种技术在治疗肿瘤，自身免疫性疾病等方面起到了积极作用。
2、car元件主要由抗体的先导肽(signal peptide，sp)单链抗体(single chainfragment variable，scfv)，铰链(hinge)，跨膜结域(transmembrane region)，胞内域(intracellular region)构成。其中scfv来源于抗体的抗体的轻链可变区(variableregions of the light chain,vl)和重链可变区(variable regions of the heavychain,vh)，两条链由linker连接构成一个单链抗体。因此，car分子结合的抗原表位类型由scfv决定，不同的scfv结合不同的抗原表位，靶向不同抗原表位的car除了scfv不同外，其他组成部分可相同。目前，针对血液肿瘤及实体肿瘤的抗原设计出了上百种car，既包括针
3、cd33是表达在髓系细胞上的一种膜蛋白，也是鉴定髓系细胞的一个关键蛋白。目前，针对cd33蛋白设计的car在制备成car-t细胞和car-nk细胞后能够有效杀伤表达cd33的髓系白血病细胞，并且在临床治疗中也出现了一定的积极效果，但是由于nk细胞会部分表达cd33，因此在制备cd33-car-nk中会出现自相残杀和扩增效率减弱的现象。这也是目前利用自然nk细胞制备cd33-car-nk的一个需要解决的难题。间皮素(mesothelin，msln)是表达在间皮细胞膜上的一种蛋白，在一些实体瘤的肿瘤细胞中超高表达，如间皮瘤，卵巢癌，胰腺癌，肺癌，胆管上皮癌等。目前临床前试验已经证明，利用msln-car-nk细胞能够有效杀人伤卵巢癌细胞，延长人卵巢癌构建的小鼠肿瘤模型生存时间。并且利用msln-car-nk细胞治疗卵巢癌已经进入了临床试验阶段。利用car技术治疗髓系白血病是很有潜力的治疗手段，目前可选的靶标膜蛋白除了cd33，cll1等外，msln蛋白是新发现的表达在部分急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,aml)患者病变细胞上的分子，约占总数的36％，并且转录本检测的msln表达值约是5-1077.6每百万tpm，因此msln也是靶向aml的一个独特靶标蛋白。目前已有研究表明msln-car-t细胞和msln-car-nk细胞能够有效杀伤表达msln的aml细胞系。并且能够有效清除肿瘤模型鼠内的肿瘤细胞，抑制肿瘤进展。但是由于msln蛋白会被从细胞膜上切掉，形成游离的msln，因此，在利用表达msln-car的免疫细胞靶向表达msln的aml细胞时，可结合效率会降低，减弱杀伤效果。
技术实现思路
1、鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供靶向cd33和mesothelin双靶点的嵌合抗原受体及其应用。
2、在本专利技术的第一方面，提供了一种靶向cd33和mesothelin双靶点的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依次连接的先导肽(signal peptide，sp)、抗原结合区、铰链区(hinge)、跨膜区(transmembrane,tm)、胞内区(activation)，所述抗原结合区包括靶向cd33的第一抗原结合区和靶向mesothelin(间皮素，msln)的第二抗原结合区。
3、进一步地，所述先导肽(signal peptide，sp)的氨基酸序列如seq id no.10所示。
4、进一步地，所述先导肽(signal peptide，sp)的编码核苷酸序列如seq id no.23所示。
5、进一步地，所述铰链区包括并不限于cd8、cd28、igg1或igg4蛋白的铰链区，优选为cd8铰链区(cd8 hinge)。
6、更进一步地，所述cd8铰链区(cd8 hinge)的氨基酸序列如seq id no.11所示。
7、更进一步地，所述cd8铰链区(cd8 hinge)的编码核苷酸序列如seq id no.24所示。
8、进一步地，所述跨膜区包括并不限于cd4、cd8、cd8a、cd28、nkg2d、cd3ζ(cd247)或icos蛋白的跨膜区，优选为cd8跨膜区(cd8 tm)。
9、更进一步地，所述cd8跨膜区(cd8 tm)的氨基酸序列如seq id no.12所示。
10、更进一步地，所述cd8跨膜区(cd8 tm)的编码核苷酸序列如seq id no.25所示。
11、进一步地，所述胞内区包括并不限于cd3ζ(cd247)或fcer1g，优选为cd3ζ。
12、更进一步地，所述cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.13所示。
13、更进一步地，所述cd3ζ的编码核苷酸序列如seq id no.26所示。
14、进一步地，所述嵌合抗原受体还包括共刺激区(共刺激信号传递区，co-stimulation)。
15、更进一步地，所述共刺激区选自4-1bb、cd28、ox40、2b4和cd27中的一种或两种的组合。
16、进一步地，所述嵌合抗原受体还包括利于t细胞或nk细胞存活激活的细胞因子或蛋白配体。
17、更进一步地，所述利于t细胞或nk细胞存活激活的细胞因子或蛋白配体包括并不限于cxcr1、cxcr、pdl1、il-2或il-15。
18、进一步地，所述抗原结合区具有如下具体结构：
19、t1-scfv：从n端到c端顺序，首先将cd33 scfv的vl(cd33 scfv-vl)通过linker 1与cd33 scfv的vh(cd33 scfv-vh)连接在一起，形成cd33 scfv，将msln scfv的vl(mslnscfv-vl)通过linker 3与msln scfv的vh(msln-scfv-vh)连接在一起，形成msln scfv。进而将cd33 scfv通过linker 2与msln scfv连接在一起，形成cd33 scfv-vl-linker 1-cd33scfv-vh-linker 2-msln scfv-vl-msln scfv-v本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向CD33和mesothelin双靶点的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依次连接的先导肽、抗原结合区、铰链区、跨膜区、胞内区，所述抗原结合区包括靶向CD33的第一抗原结合区和靶向mesothelin的第二抗原结合区；
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合区具有如下具体结构：
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括共刺激区和/或利于T细胞或NK细胞存活激活的细胞因子或蛋白配体；
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.27-30所示。
5.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体。
6.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求5所述的核酸。
7.一种重组细胞，其特征在于，所述细胞表达权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体或含有权利要求5所述的核酸或含有权利要求6所述的重组载体。
8.根据权利要求7所述的重组细胞，其特征在于，所述
9.一种表达权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体的诱导性免疫细胞，其特征在于，所述诱导性免疫细胞由权利要求8所述的重组多能干细胞诱导制备。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求7或8所述的重组细胞或权利要求9所述的诱导性免疫细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。
11.权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求5所述的核酸、权利要求6所述的重组载体、权利要求7或8所述的重组细胞、权利要求9所述的诱导性免疫细胞、权利要求10所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途；
...【技术特征摘要】
1.一种靶向cd33和mesothelin双靶点的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依次连接的先导肽、抗原结合区、铰链区、跨膜区、胞内区，所述抗原结合区包括靶向cd33的第一抗原结合区和靶向mesothelin的第二抗原结合区；
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合区具有如下具体结构：
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括共刺激区和/或利于t细胞或nk细胞存活激活的细胞因子或蛋白配体；
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no.27-30所示。
5.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体。
6.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求5所述的核酸。
...【专利技术属性】
技术研发人员：胡房晓，王瑶，黄德浩，夏成祥，刘艳红，郑秀娟，翁启童，祁翰蒙，沈义媛，陈逸，
申请(专利权)人：北京干细胞与再生医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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