一种快速检测芹菜尾孢菌的引物组及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测芹菜尾孢叶斑病病原芹菜尾孢菌的引物组和检测方法。本发明专利技术针对芹菜尾孢菌特异的尾孢菌素促进蛋白（cercosporin facilitator protein，cfp）基因序列设计和筛选了一套特异性的检测引物组，该引物组由2条特异性引物cfp

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测芹菜尾孢菌的引物组及检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速检测芹菜尾孢菌的检测引物组及检测方法。

技术介绍

[0002]芹菜尾孢（Cercospora apii）是一种重要的植物病原真菌，被发现可寄生于热带及亚热带等地区的伞形花科蔬菜。它主要危害植物的叶片，形成典型的病斑，也可侵染茎，严重时造成落叶、早衰等现象。近年来，我国芹菜等尾孢叶斑病的危害逐年加重，在幼苗期和成株期均能发病，以成株期受害较为严重，主要危害芹菜叶片，也可危害叶柄和茎，一般发病率在20%~40%，严重达60%以上，导致芹菜产量和质量严重下降，成为芹菜生产发展的重要限制因素。芹菜尾孢菌初侵染源主要为种子或残留病株，病菌以附着在种子表面和侵入种皮内的菌丝及残留病株和土壤中菌丝与孢子越冬，在环境条件适宜时，菌丝体产生分生孢子，通过气流传播至寄主植物上，在水滴存在的条件下从寄主表皮直接侵入，引起初次侵染。播种带病种子，出苗后即可染病，并在受害的部位产生新一代分生孢子，借气流风雨传播，进行多次再侵染，周而复始一直延续到秋末，危害逐步加重。
[0003]由芹菜尾孢菌引起的芹菜尾孢叶斑病在叶片上症状多样，极易与其它病原菌引起的病害相混淆，病原菌侵染不同时期，与芹菜链格孢叶斑病、斑枯病和细菌性叶斑病产生相似的症状。在田间由于许多农民误、错诊，而没有对病害进行及时有效的控制，造成巨大的经济损失。因此，建立芹菜尾孢叶斑病的快速检测技术，对病害发生的预测预报具有重要的意义。
[0004]目前，植物组织中芹菜尾孢菌的检测主要沿用传统的组织分离培养、形态学特征观察、致病力鉴定等方法，检测周期长，灵敏性低，易受人为及环境等诸多因素干扰，不易在病害潜伏期和初发期作出及时正确的诊断。
[0005] 近年来，随着分子生物学的发展，基于PCR 技术的检测方法以成功应用于多种病原菌的检测。目前，PCR检测方法已经成功应用于多种植物病原微生物的检测，具有特异性强和灵敏度高的优点如番茄黄化曲叶病毒、柑橘溃疡菌、镰刀菌、小麦叶锈病菌等，在病害发病初期即可快速的对病害进行诊断，及时指导农民采取有效的防治措施。而对基于尾孢菌素促进蛋白cfp基因的检测目前还没有报道。可以作为植物病害早期检测技术在基层推广应用。
[0006]本专利技术利用芹菜尾孢特异性的毒素蛋白cfp基因序列特征设计了2条特异性引物，在此基础上建立芹菜尾孢的特异性分子检测方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是建立一种芹菜尾孢菌的特异性好、灵敏度高、快速简单的PCR分子检测技术，
技术实现思路
涉及芹菜尾孢菌——尾孢菌素促进蛋白cfp基因的特异性引物对，和利用该引物对建立的分子检测方法。
[0008]为实现上述目的，本专利技术公开了如下的
技术实现思路
： 一种用于快速检测芹菜尾孢叶斑病病原芹菜尾孢菌（Cercospora apii）的尾孢菌素促进蛋白cfp基因的特异性引物，其特征在于所述的引物对为正向引物cfp
‑
F和反向引物cfp
‑
R，引物的核酸序列为cfp
‑
F（5
’ꢀ
to3
’
）：TAGAAATGACTGGCATAGTC；cfp
‑
R（5
’ꢀ
to3
’
）：GTCATAGCCAATAAGCTAGC。
[0009]本专利技术进一步公开了采用所述的特异性引物进行芹菜尾孢叶斑病病原芹菜尾孢菌的检测方法：提取待测样品的DNA，然后通过聚合酶链式反应扩增的方法利用检测引物组对待检样品DNA进行特异性扩增，确认是否存在扩增产物。所述的待测样品为芹菜叶片组织，或真菌纯培养物。所述的通过PCR扩增的方法对菜尾孢菌的DNA进行特异性扩增，具体扩增体系总体积为25μL，包括2
×
taq Master Mix：12.5μL；引物cfp
‑
F：1μL；引物cfp
‑
R：1μL；ddH2O：9.5μL和1μL DNA模板；其中2
×
taq Master Mix成分为：20 mmol/L Tris
‑
HCl，0.1mmol/L EDTA，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs，余量为灭菌ddH2O。
[0010]本专利技术同时也公开了芹菜尾孢叶斑病病原芹菜尾孢菌的快速检测方法，采用特异性引物；扩增反应体系依据权利要求5配制；将配制好的反应液进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸45s，32个循环后；72℃延伸10min；扩增反应结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件100V~110V，20min~30min。在817bp位置产生特异性条带作为结果判定，产生特异性条带表示检测结果为阳性，存在芹菜尾孢叶斑病病原芹菜尾孢菌（C. apii），在817bp位置未存在特异性条带表示检测结果为阴性，不存在芹菜尾孢叶斑病病原芹菜尾孢菌（C. apii）所述的待检样品可以为芹菜叶片等组织或者真菌纯培养物。
[0011]本专利技术更进一步公开了用于快速检测芹菜尾孢叶斑病病原芹菜尾孢菌（C. apii）的尾孢菌素促进蛋白cfp基因的特异性引物在用于快速检测芹菜尾孢菌方面的应用。实验结果显示：检测结果可以准确的判定待检测样品中是否存在芹菜尾孢菌（C. apii）的尾孢菌素促进蛋白cfp基因,从而实现对芹菜尾孢菌的快速检测。本专利技术筛选到的一组特异性引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率好、检测时间短，操作简单等特点。
[0012]本专利技术更加详细的描述如下：本专利技术提取待测样品的DNA，然后通过聚合酶链式反应（PCR）扩增的方法利用检测引物组对待检样品DNA进行特异性扩增，确认是否存在扩增产物。所述的待测样品为芹菜叶片组织，或真菌纯培养物。通过PCR扩增的方法对芹菜尾孢菌的DNA进行特异性扩增，具体扩增体系总体积为25μL，包括2
×
taq Master Mix：12.5μL；引物cfp
‑
F：1μL；引物cfp
‑
R：1μL；ddH2O：9.5μL和1μL （2.5ng/μL
‑
7.5ng/μL）DNA模板；其中2
×
taq Master Mix成分为：20 mmol/L Tris
‑
HCl，0.1mmol/L EDTA，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs，余量为灭菌ddH2O。将配制好的反应液进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸45s，32个循环后；72℃延伸10min，扩增反应结束。
[0013]所述的扩增产物的检测，可以利用电泳检测。进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件100V~110V，20min
‑
30min，在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于快速检测芹菜尾孢叶斑病病原芹菜尾孢菌（Cercospora apii）的尾孢菌素促进蛋白cfp基因的特异性引物，其特征在于所述的引物对为正向引物cfp
‑
F和反向引物cfp
‑
R，引物的核酸序列为cfp
‑
F（5
’ꢀ
to3
’
）：TAGAAATGACTGGCATAGTC；cfp
‑
R（5
’ꢀ
to3
’
）：GTCATAGCCAATAAGCTAGC。2.权利要求1所述用于快速检测芹菜尾孢叶斑病病原芹菜尾孢菌（C. apii）的尾孢菌素促进蛋白cfp基因的特异性引物在用于快速检测芹菜尾孢菌方面的应用。3.采用权利要求1所述的特异性引物进行芹菜尾孢叶斑病病原芹菜尾孢菌的检测方法，其特征在于提取待测样品的DNA，然后通过聚合酶链式反应扩增的方法利用权利要求1所述的检测引物组对待检样品DNA进行特异性扩增，确认是否存在扩增产物。4.权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的待测样品为芹菜叶片组织，或真菌纯培养物。5.权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述的通过PCR扩增的方法对菜尾孢菌的DNA进行特异性扩增，具体扩增体系...

【专利技术属性】
技术研发人员：王勇，高苇，杨利娟，张春祥，高国训，
申请(专利权)人：天津市农业科学院，
类型：发明
国别省市：