一种基于DNAzyme调控基因编辑的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种基于DNAzyme调控基因编辑的方法。方法包括：将CRISPR/Cas9系统中的gRNA的5

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNAzyme调控基因编辑的方法


[0001]本专利技术属于生物材料
，具体涉及一种基于DNAzyme调控基因编辑的方法。

技术介绍

[0002]现有技术中如何对CRISPR/Cas9系统中基因编辑调控主要有两种方法：(1)利用miRNA诱导启动CRISPR基因编辑平台：通过设计具有miRNA结合位点的没有活性的sgRNA前体，使得只有在特定miRNA表达的细胞中，才会通过miRNA介导的切割反应产生成熟的sgRNA,继而引导CRISPR基因编辑体系启动工作；该方法需要针对特定的细胞寻找特定的miRNA,再根据miRNA的序列设计gRNA前体，不具有普适性。(2)基于上转换纳米粒子(UCNPs)的CRISPR/Cas9递送系统：在该递送系统中，CRISPR/Cas9通过光敏分子ONA共价锚定在UCNP上(表示为UCNPs
‑
Cas9)，然后用聚乙烯亚胺(PEI)包被(表示为UCNPs
‑
Cas9@PEI)，以形成纳米颗粒。然后，将这些纳米颗粒暴露在近红外光NIR下，上转换纳米粒子(UCNPs)吸收近红外光(NIR)辐射，将其转换为紫外光(UV)辐射，紫外光能够切断光敏分子ONA，从而将CRISPR/Cas9体系从纳米颗粒中释放出来，并将它们按需递送给细胞。但是基于光敏分子的递送系统一般只适用于浅表组织。
[0003]因此，急需建立一种设计简单、精准靶向且具有普适性的CRISPR/Cas9活性可控系统，实现对基因编辑的精准调控。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的问题，本专利技术通过对gRNA进行延长，并设计DNAzyme的碱基序列使得二者形成碱基互补配对，由于DNAzyme的屏蔽作用，CRISPR/Cas9无法识别靶DNA序列，其基因编辑能力被抑制，在特定金属离子的作用下，DNAzyme被激活，对gRNA延长位点特异性切割，使得CRISPR/Cas9系统恢复活性启动基因编辑。
[0005]为实现上述目的，本专利技术实施例提供了一种基于DNAzyme调控基因编辑的方法，所述方法具体包括：
[0006]将CRISPR/Cas9系统中的gRNA的5
’
末端进行延长，获得含有5
’
末端延长片段的gRNA前体；
[0007]根据所述gRNA前体的碱基序列设计8
‑
17DNAzyme底物结合臂的序列，获得与gRNA前体形成碱基互补配对的DNAzyme；
[0008]将所述gRNA前体和8
‑
17DNAzyme作为CRISPR/Cas9基因编辑系统原料，通过是否加入金属离子对基因编辑进行调控。
[0009]进一步的，所述gRNA的5
’
末端进行延长过程中延长的长度为13
‑
15个碱基。
[0010]进一步的，所述gRNA前体5
’
末端的延长片段与所述gRNA连接在一起没有潜在的发夹结构和互补配对情况。
[0011]进一步的，所述金属离子包括：锰离子、镁离子。
[0012]基于同一专利技术构思的，本专利技术实施例还提供了上述基于DNAzyme调控基因编辑的
方法在调控增强型绿色荧光蛋白基因表达中的应用，所述增强型绿色荧光蛋白的特异性gRNA、gRNA前体和8
‑
17DNAzyme的基因序列如序列SEQ ID NO:1
‑
3所示。
[0013]有益效果：
[0014]本专利技术通过简单的设计将目标gRNA 5
’
末端延长13
‑
15个碱基成为gRNA前体，然后根据gRNA前体序列设计8
‑
17DNAzyme序列，使得二者碱基互补，由于DNAzyme的屏蔽作用，CRISPR/Cas9无法识别靶DNA序列，其基因编辑能力被抑制，再通过加入特定金属离子，DNAzyme被激活，对gRNA延长位点特异性切割，CRISPR/Cas9系统恢复活性启动基因编辑，实现了CRISPR/Cas9系统的精准调控，且具有普适性。
附图说明
[0015]图1为本专利技术实施例提供的CRISPR/Cas9系统恢复活性启动基因编辑的示意图；
[0016]图2为本专利技术实施例提供的各组流式细胞术检测结果，A为空白对照组，B为gRNA组，C为gRNA前体组，D为gRNA前体+DNAzyme组，E为gRNA前体+DNAzyme+Mn
2+
组；
[0017]图3为本专利技术实施例提供的各组基因编辑效率统计图。
具体实施方式
[0018]为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述，但本专利技术的保护范围并不限于以下具体实施例。
[0019]除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本专利技术的保护范围。
[0020]除非另有特别说明，本专利技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0021]在CRISPR/Cas9系统，对gRNA的5
’
末端进行延长(延长13
‑
15个碱基)，成为gRNA前体，并与8
‑
17DNAzyme形成碱基互补配对。由于DNAzyme的屏蔽作用，CRISPR/Cas9无法识别靶DNA序列，其基因编辑能力被抑制。如图1所示，在特定金属离子如Mn
2+
的作用下，DNAzyme被激活，对gRNA延长位点特异性切割，CRISPR/Cas9系统恢复活性启动基因编辑。
[0022]gRNA前体5
’
末端的延长片段与原gRNA末端分别结合DNAzyme活性中心两侧的结合部位，延长片段与原gRNA末端连接部位为DNAzyme切割位点，其中gRNA延长片段的设计原则是与原gRNA连接在一起没有潜在的发夹结构和互补配对情况。
[0023]实施例
[0024]本专利技术在增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)标记细胞中的应用证明本专利技术基于DNAzyme调控基因编辑的方法可行性。利用CRISPR技术沉默EGFP标记的HEK
‑
293T细胞的绿色荧光。
[0025]具体步骤如下：
[0026](1)根据EGFP序列，设计EGFP特异性gRNA，然后对gRNA的5
’
末端进行延长设计gRNA前体；
[0027]EGFP gRNA：5
’‑
cucgugaccacccugaccua
‑3’
；
[0028]EGFP gRNA前体：
[0029]5’‑
cgucggagucgcuagcucgugaccacccugaccu本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于DNAzyme调控基因编辑的方法，其特征在于，所述方法具体包括：将CRISPR/Cas9系统中的gRNA的5
’
末端进行延长，获得含有5
’
末端延长片段的gRNA前体；根据所述gRNA前体的碱基序列设计8
‑
17DNAzyme底物结合臂的序列，获得与gRNA前体形成碱基互补配对的8
‑
17DNAzyme；将所述gRNA前体和8
‑
17DNAzyme作为调控CRISPR/Cas9基因编辑系统原料，通过是否加入金属离子对基因编辑进行调控。2.根据权利要求1所述的基于DNAzyme调控基因编辑的方法，其特征在于，所述gRNA的5
’
末端进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：周文虎，董丽萍，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：