一种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)从肿瘤组织中提取肿瘤淋巴细胞TILs；(2)分选富集TILs中PD1阳性T细胞；(3)一次性将PBR转化融合蛋白和IL

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，属于肿瘤浸润淋巴细胞制备


技术介绍

[0002]肿瘤目前是对人类威胁最大的疾病之一，早期发现通过手术、化疗等常规治疗多数只能延缓病情，发展到晚期则缺乏较好的治疗手段。近年来免疫治疗技术发展迅速，不论CAR
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T还是PD1/PD
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L1免疫卡控点抗体药物陆续上市，为肿瘤治疗带来希望。针对肿瘤的免疫细胞研究如火如荼，并取得一些进展，包括目前全球上市的DC疫苗、CAR
‑
T，然而目前大部分免疫细胞技术都是针对肿瘤单靶点或少数几个靶点，面对异质性较强的肿瘤疗效有限。
[0003]TILs作为常规过继免疫细胞疗法已经有40多年的临床应用，相较于外周血培养的LAK、CIK等免疫细胞而言，TILs中因相对较多的肿瘤特异性杀伤T细胞，因此在包括黑色素、卵巢癌、乳腺癌等众多肿瘤中均取得一定的治疗效果，而越来越多的临床试验加速TILs作为一种特殊的免疫细胞治疗技术或药物上市，为众多肿瘤的治疗提供一种选择。
[0004]然而临床试验也发现TILs的众多不足之处：
①
首当其冲是异质性较强，虽然TILs含有的肿瘤特异性杀伤T细胞，但是大部分免疫细胞不具备肿瘤杀伤功能，而且不同患者TILs含有的肿瘤特异性杀伤T细胞数量不一，而制备中是无选择性的扩增，最终导致不同患者制备的TILs质量不一，因此也导致后续临床效果大不相同；
②
>传统技术制备的TILs面临来自肿瘤微环境中PD1信号通路的抑制，因此无法最大程度发生肿瘤杀伤作用；
③
传统技术制备的TILs活力差，体内存活时间短，综上述原因导致传统的TILs临床疗效不一，需要通过技术升级突破治疗瓶颈。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对上述技术问题，本专利技术提供了种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法。
[0006]技术方案：为达到上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)从肿瘤组织中提取肿瘤淋巴细胞TILs；
[0009](2)分选富集TILs中PD1阳性T细胞；
[0010](3)一次性将PBR转化融合蛋白和IL
‑
15超级复合物整合到PD1阳性T细胞中；所述PBR转化融合蛋白包括：PD1的胞外区、41BB的胞内区和
△
IL2RB(YRHQ)的截段，并按顺序连接；所述IL
‑
15超级复合物包括：信号肽、“自杀基因”R结构、Linker1、白细胞介素
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15突变体IL
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15
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M
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N72D、Linker2、白细胞介素
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15受体α的Sushi结构域、CD
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4跨膜区，并按顺序连接；
[0011](4)通过扩增培养，获得肿瘤增强型TILs。
[0012]优选的，步骤(1)中，经病理组织学确认的肿瘤组织，经组织块破碎法处理后，浸润于培养液中，后从组织中游离出来所述TILs；所述肿瘤组织选自前列腺癌组织、肺癌组织或
胃癌组织等。
[0013]优选的，步骤(2)中，通过抗体磁珠分选富集TILs中PD1阳性T细胞。
[0014]进一步优选的，所述通过抗体磁珠分选富集，是指按顺序使用下列试剂先分选出PD1阳性的TILs细胞：
[0015]CD279(PD1)Antibody、Anti
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APC MicroBeads、Support Kit、CD20 Cytoplasmic Antibody、Anti
‑
PE MicroBeads UltraPure和Support Kit。
[0016]优选的，步骤(3)中，利用PB转座子系统以电转的方式一次性将PBR转化融合蛋白和IL
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15超级复合物整合到PD1阳性T细胞中。
[0017]优选的，步骤(3)中，所述PD1的胞外区、41BB的胞内区和
△
IL2RB(YRHQ)的截段的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；编码所述PD1、41BB和
△
IL2RB(YRHQ)的DNA序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
[0018]优选的，步骤(3)中，所述信号肽、“自杀基因”R结构、Linker1、白细胞介素
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15突变体IL
‑
15
‑
M
‑
N72D、Linker2、白细胞介素
‑
15受体α的Sushi结构域和CD
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4跨膜区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示；编码所述信号肽、“自杀基因”R结构、Linker1、白细胞介素
‑
15突变体IL
‑
15
‑
M
‑
N72D、Linker2、白细胞介素
‑
15受体α的Sushi结构域和CD
‑
4跨膜区的DNA序列分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示。
[0019]优选的，步骤(3)中，所述一次性将PBR转化融合蛋白和IL
‑
15超级复合物整合到PD1阳性T细胞中前，先将所述IL
‑
15超级复合物与PBR连接，两者连接所用的2A连接肽为P2A或F2A；所述P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，编码所述P2A的DNA序列如SEQ ID NO:22所示。
[0020]优选的，步骤(4)中，所述扩增培养使用的培养基为无血清的悬浮细胞培养基，进一步优选AIM
‑
V(Gibco，USA)培养基。
[0021]一种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞，由上述制备方法制得。
[0022]优选的，所述增强型TILs的制备方法包括如下步骤：
[0023]采用细胞培养液培养肿瘤浸润淋巴细胞。
[0024]1、通过手术获得患者的肿瘤组织样本并经病理确认；
[0025]2、将患者肿瘤组织样本用PBS进行浸泡、清洗，尽量去除组织中的结缔组织和坏死组织；
[0026]3、将清洗干净的肿瘤组织移入干净的培养皿中，用手术剪进行剪碎，大小约1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从肿瘤组织中提取肿瘤淋巴细胞TILs；(2)分选富集TILs中PD1阳性T细胞；(3)一次性将PBR转化融合蛋白和IL
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15超级复合物整合到PD1阳性T细胞中；所述PBR转化融合蛋白包括：PD1的胞外区、41BB的胞内区和
△
IL2RB(YRHQ)的截段，并按顺序连接；所述IL
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15超级复合物包括：信号肽、“自杀基因”R结构、Linker1、白细胞介素
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15突变体IL
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15
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M
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N72D、Linker2、白细胞介素
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15受体α的Sushi结构域、CD
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4跨膜区，并按顺序连接；(4)通过扩增培养，获得肿瘤增强型TILs。2.根据权利要求1所述的肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，经病理组织学确认的肿瘤组织，经组织块破碎法处理后，浸润于培养液中，后从组织中游离出来所述TILs；所述肿瘤组织选自前列腺癌组织、肺癌组织或胃癌组织。3.根据权利要求1所述的肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，通过抗体磁珠分选富集TILs中PD1阳性T细胞。4.根据权利要求3所述的肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述通过抗体磁珠分选富集，是指按顺序使用下列试剂分选出PD1阳性的TILs细胞：CD279(PD1)Antibody、Anti
‑
APC MicroBeads、Support Kit、CD20 Cytoplasmic Antibody、Anti
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PE MicroBeads UltraPure和Support Kit。5.根据权利要求1所述的肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，利用PB转座子系统以电转的方式一次性将PBR转化融合蛋白和IL
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15超级复合物整合到PD1阳性T细胞中。6.根据权利要求1所述的肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PD1的胞外区、41BB的胞内区和
△
IL2RB(YRHQ)的截段的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振宇，伍耀，何银梅，
申请(专利权)人：皖南医学院第一附属医院皖南医学院弋矶山医院，
类型：发明
国别省市：