【技术实现步骤摘要】
用于转导及细胞处理的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请主张2014年11月05日提交的名称为“用于转导及细胞处理的方法(Methods for Transduction and Cell Processing)”的美国临时申请第62/075,801号及2015年3月05日提交的名称为“用于转导及细胞处理的方法(Methods for Transduction and Cell Processing)”的美国临时申请第62/129,023号的优先权，所述临时申请的内容以全文引用的方式并入。
[0003]本专利技术涉及用于治疗用途(例如用于过继细胞疗法)的细胞处理。所提供的方法一般包括转导方法，其中细胞和病毒载体颗粒在一定条件下孵育，使得细胞转导有病毒载体。孵育可在一般刚性的离心室(例如由硬塑料制成的圆柱形离心室)的内部空腔进行。所述方法包括其他处理步骤，包括在此离心室中进行的步骤，包括洗涤、选择、分离、培养及配制。具体地，本专利技术涉及提供优于可用处理方法(例如可用于大规模处理的方法)的优势的方法。此类优势包括例如降低成本、流线化、增加功效、增加安全性及增加在不同对象及条件中的再现性。
技术介绍
[0004]某些方法可用于细胞处理，包括大规模方法及适用于制备用于过继细胞疗法的细胞的方法。举例而言，用于病毒载体转移的方法，例如转导、选择、分离、刺激、培养、洗涤及配制为可用的。可用方法尚未完全令人满意。举例而言，对于用于过继细胞疗法的细胞的大规模处理(例如转导)，需要改良方法。举例而言...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种转导方法，其包括：在离心室的内部空腔中孵育输入组合物，该输入组合物包含细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒，其中该离心室能围绕旋转轴旋转，并且包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性侧壁及至少一个开口，该侧壁的至少一部分包围该内部空腔，且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出；该离心室在该孵育的至少一部分期间围绕该旋转轴旋转；及该方法产生输出组合物，该输出组合物包含用该病毒载体转导的多个细胞。2.一种转导方法，其包括：在离心室的内部空腔中孵育输入组合物，该输入组合物包含细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒，该离心室能围绕旋转轴旋转，并且包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔，且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出，其中：该离心室在该孵育的至少一部分期间围绕该旋转轴旋转；在该离心室旋转期间，存在于该空腔中的该输入组合物的总液体体积不超过约5mL/平方英寸该空腔的内部表面积；及该方法产生输出组合物，该输出组合物包含用该病毒载体转导的多个细胞。3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该旋转包括以在该空腔侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处的大于约200g、大于约300g或大于约500g的相对离心力(RCF)旋转。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该旋转包括以在该空腔侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处的如下相对离心力旋转：在或约在600g、800g、1000g、1100g、1600g、2000g、2100g、2200g、2500g或3000g；或至少或至少约600g、800g、1000g、1100g、1600g、2000g、2100g、2200g、2500g或3000g。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该旋转包括以在该空腔侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处的如下数值范围的相对离心力或约如下数值范围的相对离心力旋转：500g至2500g、500g至2000g、500g至1600g、500g至1000g、600g至1600g、600g至1000g、1000g至2000g或1000g至1600g，各包括端点。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在该孵育的至少一部分期间，该室旋转如下时间：大于或约5分钟、大于或约10分钟、大于或约15分钟、大于或约20分钟、大于或约30分钟、大于或约45分钟、大于或约60分钟、大于或约90分钟或大于或约120分钟；或，5分钟至60分钟之间或约5分钟至60分钟之间、10分钟至60分钟之间或约10分钟至60分钟之间、15分钟至60分钟之间或约15分钟至60分钟之间、15分钟至45分钟之间或约15分钟至45分钟之间、30分钟至60分钟之间或约30分钟至60分钟之间，或45分钟至60分钟之间或约45分钟至60分钟之间，各包括端点。7.如权利要求1至6中任一项所述的转导方法，其中该离心室还包含可移动构件且该内部空腔为具有由该端壁、该基本上刚性的侧壁及该可移动构件限定的可变体积的空腔，该可移动构件能够在该离心室内移动以改变该空腔的内部体积。8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该侧壁为曲线形。9.如权利要求8所述的方法，其中该侧壁为大体上的圆柱形。
10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中：该可移动构件为活塞；和/或该可移动构件能够在该离心室内轴向性地移动以改变该空腔的内部体积。11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该至少一个开口包括入口及出口，其分别能够允许该引入及该压出；或该至少一个开口包含单一入口/出口，其能够允许该引入及该压出。12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中该至少一个开口与该室是同轴的且位于该端壁中。13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中：该空腔的内部表面积为至少或至少约1
×
109μm2；该空腔的内部表面积为至少或至少约1
×
10
10
μm2；该刚性壁在自该端壁延伸的方向的长度为至少约5cm；该刚性壁在自该端壁延伸的方向的长度为至少约8cm；和/或该空腔在至少一个截面的半径为至少约2cm。14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中：在该孵育期间，存在于该空腔中的该输入组合物的平均液体体积不超过约5毫升(mL)/平方英寸该孵育期间的该空腔的内部表面积；在该孵育期间的任何时间处，存在于该空腔中的该输入组合物的最大液体体积不超过约5mL/平方英寸该空腔的最大内部表面积；在该孵育期间，存在于该空腔中的该输入组合物的平均液体体积不超过约2.5毫升(mL)/平方英寸该孵育期间的该空腔的内部表面积；或，在该孵育期间的任何时间处，存在于该空腔中的该输入组合物的最大液体体积不超过约2.5mL/平方英寸该空腔的最大内部表面积。15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中在该旋转期间存在于该空腔中的该输入组合物的液体体积介于如下数值之间或介于约如下数值之间：0.5mL/平方英寸该空腔的内部表面积(毫升/平方英寸)至5毫升/平方英寸、0.5毫升/平方英寸至2.5毫升/平方英寸、0.5毫升/平方英寸至1毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸至5毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸至2.5毫升/平方英寸、或2.5毫升/平方英寸至5毫升/平方英寸。16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中：该输入组合物中所述细胞的数目是或约是足以在该离心室以在该侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处的1000g或约1000g或2000g或约2000g的力旋转期间在该空腔的表面上形成单层的所述细胞的数目；和/或该输入组合物中所述细胞的数目是足以在该离心室以在该侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处的1000g或约1000g或2000g或约2000g的力旋转期间在该空腔的表面上形成单层的所述细胞的数目的不超过1.5倍或2倍。17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约1
×
106个所述细胞；或该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约5
×
106个所述细胞；或该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约1
×
107个所述细胞；或该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约1
×
108个所述细胞。18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约1
×
107个所述细胞、至少或至少约2
×
107个所述细胞、至少或至少约3
×
107个所述细胞、至少或至少约4
×
107个所述细胞、至少或至少约5
×
107个所述细胞、至少或至少约6
×
107个所述细胞、至少或至少约7
×
107个所述细胞、至少或至少约8
×
107个所述细胞、至少或至少约9
×
107个所述细胞或约所述数目的所述细胞、至少或至少约1
×
108个所述细胞、至少或至少约2
×
108个所述细胞、至少或至少约3
×
108个所述细胞，或至少或至少约4
×
108个所
述细胞。19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中：该输入组合物包含每个所述细胞至少或至少约1个感染单位(infectious unit；IU)的病毒颗粒、每个所述细胞至少或至少约2个IU、每个所述细胞至少或至少约3个IU、每个所述细胞至少或至少约4个IU、每个所述细胞至少或至少约5个IU、每个所述细胞至少或至少约10个IU、每个所述细胞至少或至少约20个IU、每个所述细胞至少或至少约30个IU、每个所述细胞至少或至少约40个IU、每个所述细胞至少或至少约50个IU或每个所述细胞至少或至少约60个IU；或该输入组合物包含每个所述细胞1个或约1个感染单位(IU)的病毒颗粒、每个所述细胞2个或约2个IU、每个所述细胞3个或约3个IU、每个所述细胞4个或约4个IU、每个所述细胞5个或约5个IU、每个所述细胞10个或约10个IU、每个所述细胞20个或约20个IU、每个所述细胞30个或约30个IU、每个所述细胞40个或约40个IU、每个所述细胞50个或约50个IU或每个所述细胞60个或约60个IU。20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中：在该孵育期间的任何时间处，存在于该空腔中的该输入组合物的最大总液体体积为该空腔中所述细胞的总体积的不超过2倍、不超过10倍或不超过100倍，或该输入组合物在该孵育过程中的平均体积为该空腔中细胞总体积的不超过2、10或100倍。21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中在该孵育期间的任何时间处，存在于该空腔中的该输入组合物的最大体积或在该孵育过程中的平均体积为在该离心室以在该侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处的1000g或约1000g或2000g或约2000g的力旋转期间在该空腔的内表面上形成的所述细胞的单层的体积的不超过下列倍数或不超过约下列倍数：2倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中该输入组合物的液体体积不超过20mL、不超过40mL、不超过50mL、不超过70mL、不超过100mL、不超过120mL、不超过150mL或不超过200mL。23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中该输入组合物在该孵育的至少一部分期间占该内部空腔的全部或基本上全部体积。24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中在该室中孵育的至少一部分期间或在该室旋转期间，该输入组合物的液体体积仅占该室的内部空腔体积的一部分，在该至少一部分期间或在该旋转期间，该空腔的体积还包含气体，该气体在该孵育之前或期间通过该至少一个开口引入至该空腔中。25.如权利要求24所述的方法，其中该离心室包含可移动构件，从而气体向该离心室中的引入实现该可移动构件的移动以增加该室的内部空腔的体积，从而与该室中不存在气体时相比，减少在该离心室旋转期间存在于该空腔中的该输入组合物的每平方英寸该空腔的内部表面积的总液体体积。26.一种转导方法，其包括：a)向内部表面积为至少1
×
109μm2或约1
×
109μm2或至少1
×
10
10
μm2或约1
×
10
10
μm2的离心室的内部空腔提供：i)输入组合物，其包含细胞及包含重组病毒载体的病毒颗粒，其中：该输入组合物中的细胞数目为至少1
×
107个细胞，及所述病毒颗粒以每个所述细胞至少是或约是1个感染单位(IU)存在于该输入组合物中，及该输入组合物的液体体积小于该离心室的内部空腔的最大体积；及ii)体积至多为该离心室的内部空腔的剩余最大体积的气体；及b)孵育该输入组合物，其中该孵育的至少一部分在该离心室
的该内部空腔中进行，同时实现该离心室的旋转；及其中该方法产生输出组合物，该输出组合物包含用该病毒载体转导的多个细胞。27.如权利要求26所述的方法，其中：该细胞数目为至少或至少约50
×
106个细胞；至少或至少约100
×
106个细胞；或至少或至少约200
×
106个细胞；和/或所述病毒颗粒以至少每个细胞1.6个IU、每个细胞1.8个IU、每个细胞2.0个IU、每个细胞2.4个IU、每个细胞2.8个IU、每个细胞3.2个IU或每个细胞3.6个IU、每个细胞4.0个IU、每个细胞5.0个IU、每个细胞6.0个IU、每个细胞7.0个IU、每个细胞8.0个IU、每个细胞9.0个IU或每个细胞10.0个IU存在。28.如权利要求26或权利要求27所述的方法，其中：该输入组合物的液体体积小于或等于200mL、小于或等于100mL、小于或等于50mL、或小于或等于20mL；和/或，该输入组合物的液体体积是旋转期间该空腔的内部表面积或该空腔的最大内部表面积的体积的不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过20％或不超过10％。29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中该气体体积为至多200mL、至多180mL、至多140mL或至多100mL。30.如权利要求26至29中任一项所述的方法，其中该旋转为在该空腔的侧壁内表面或在所述细胞的表层处的至少或至少约下列数值的相对离心力：600g、800g、1000g、1100g、1500g、1600g、2000g、2400g、2600g、2800g、3000g、3200g或3600g。31.一种转导方法，其包括，孵育包含细胞及包含重组病毒载体的病毒颗粒的输入组合物，该孵育的至少一部分在旋转条件下进行，从而产生包含用该病毒载体转导的多个细胞的输出组合物，其中：该输入组合物的体积大于或约20mL、50mL、至少100mL或至少150mL和/或该输入组合物包含至少1
×
108个细胞；及所述旋转条件包含在所述细胞的表层处的大于约800g或大于约1000g或大于约1500g的相对离心力。32.如权利要求31所述的方法，其中：该输出组合物中至少25％或至少50％的所述细胞经该病毒载体转导；和/或该输出组合物中至少25％或至少50％的所述细胞表达该病毒载体内所包含的异源核酸的产物。33.如权利要求31或权利要求32所述的方法，其中该孵育在离心室的空腔中进行，且该输入组合物中的所述细胞的数目为或约为足以在该旋转期间在该空腔的内表面上形成单层或双层的所述细胞的数目。34.如权利要求33所述的方法，其中该离心室包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性侧壁及至少一个开口，其中该侧壁至少一部分包围该内部空腔，且该至少一个开口能够允许流体引入至该内部空腔中及流体自该空腔压出。35.如权利要求34所述的方法，其中该离心室还包含可移动构件且该内部空腔为具有由该端壁、该基本上刚性侧壁及该可移动构件所限定的可变体积的空腔，该可移动构件能够在该离心室内移动以改变该空腔的内部体积。36.如权利要求1至30或33至35中任一项所述的方法，其中该空腔中该输入组合物在该孵育的至少一部分期间包含至少20mL或至少50mL的液体体积，以及一百万个或约一百万个细胞/cm2该空腔的内部表面积。37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中该孵育的另一部分在该离心室外面和/或在无旋转的情况下进行，该另一部分在该室中和/或在旋转下进行至少一部分之后进
行。38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中该孵育的至少一部分在该室的该空腔中进行和/或该孵育的另一部分在37℃
±
2℃或约37℃
±
2℃下实现。39.如权利要求37或权利要求38所述的方法，其中该孵育还包含在该孵育期间将至少多个所述细胞转移至容器中，并且该孵育的该另一部分在该容器中实现。40.如权利要求39所述的方法，其中该转移在封闭系统内进行，其中该离心室及容器与该封闭系统是一体的。41.如权利要求37至40中任一项所述的方法，其中：该孵育进行一段介于下列的时间：1小时或约1小时至96小时或约96小时、4小时或约4小时至72小时或约72小时、8小时或约8小时至48小时或约48小时、12小时或约12小时至36小时或约36小时、6小时或约6小时至24小时或约24小时、36小时或约36小时至96小时或约96小时，包括端点；或，该孵育的该另一部分进行一段下列时间：1小时或约1小时至96小时或约96小时、4小时或约4小时至72小时或约72小时、8小时或约8小时至48小时或约48小时、12小时或约12小时至36小时或约36小时、6小时或约6小时至24小时或约24小时、36小时或约36小时至96小时或约96小时，包括端点。42.如权利要求37至41中任一项所述的方法，其中：该孵育进行不超过48小时、不超过36小时或不超过24小时的一段时间；或该孵育的该另一部分进行不超过48小时、不超过36小时或不超过24小时的一段时间。43.如权利要求37至41中任一项所述的方法，其中：该孵育在刺激剂存在下进行；和/或该孵育的该另一部分在刺激剂存在下进行。44.如权利要求37至41中任一项所述的方法，其中：该孵育进行不超过24小时的一段时间；该组合物中的所述细胞尚未经受高于30℃的温度超过24小时；和/或该孵育并非在刺激剂存在下进行。45.如权利要求43或权利要求44所述的方法，其中该刺激剂为能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞增殖的药剂。46.如权利要求43至45中任一项所述的方法，其中该刺激剂为选自IL
‑
2、IL
‑
15及IL
‑
7的细胞因子。47.如权利要求1至46中任一项所述的方法，其中含有转导细胞的该输出组合物包含至少或至少约1
×
107个细胞，或至少或至少约5
×
107个细胞。48.如权利要求47所述的方法，其中含有转导细胞的该输出组合物包含至少或至少约1
×
108个细胞、2
×
108个细胞、4
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108个细胞、6
×
108个细胞、8
×
108个细胞或1
×
109个细胞。49.如权利要求47或权利要求48所述的方法，其中所述细胞为T细胞。50.如权利要求49所述的方法，其中所述T细胞为未分级分离T细胞、经分离的CD4+T细胞和/或经分离的CD8+T细胞。51.如权利要求1至50中任一项所述的方法，其中该方法使得该病毒载体整合至该至少多个细胞中一个或多个的宿主基因组中和/或整合至该输出组合物中至少20％或约20％、或至少30％或约30％，或至少40％或约40％的所述细胞的宿主基因组中。52.如权利要求1至51中任一项所述的方法，其中：该输入组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞通过该方法经该病毒载体转导；和/或，该输出组合物中至少2.5％、至少
5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞经该病毒载体转导；和/或，该输出组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞表达该病毒载体内所包含的异源核酸的产物。53.如权利要求1至52中任一项所述的方法，其中，对于以每个细胞约1或约2个IU的比率包含病毒的输入组合物而言，该方法能够产生以下的输出组合物，其中通过该方法产生的该输出组合物中至少10％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞包含该重组病毒载体和/或表达该载体内所包含的重组核酸的产物。54.如权利要求1至53中任一项所述的方法，其中：在含有该重组病毒载体或该病毒载体整合至其中该输出组合物中的所有所述细胞当中，该重组病毒载体的平均拷贝数不超过约10、不超过约5、不超过约2.5或不超过约1.5；或在该输出组合物中的所述细胞当中，该载体的平均拷贝数不超过约2、不超过约1.5或不超过约1。55.如权利要求1至30及33至54中任一项所述的方法，其中该离心室与封闭系统是一体的，该封闭系统包含该离心室及通过至少一个连接器操作性地连接于该至少一个开口的至少一个管线，从而允许液体及气体在该系统的至少一个构型中在该空腔与该至少一个管线之间移动。56.如权利要求55所述的方法，其中：该至少一个管线包含一系列管线；该至少一个连接器包含多个连接器；及该封闭系统还包含操作性地连接于该一系列管线的至少一个容器，该连接允许液体和/或气体通过该一系列管线在该至少一个容器与该至少一个开口之间通过。57.如权利要求55或56所述的方法，其中该至少一个连接器包含选自阀、鲁尔端口及刺突的连接器。58.如权利要求55至57中任一项所述的方法，其中该至少一个连接器包含旋转阀。59.如权利要求58所述的方法，其中该旋转阀为活栓或多旋转端口。60.如权利要求55至59中任一项所述的方法，其中该至少一个连接器包含无菌连接器。61.如权利要求56至60中任一项所述的方法，其中该至少一个容器包含选自袋、小瓶及注射器的容器。62.如权利要求56至61中任一项所述的方法，其中该至少一个容器包含稀释剂容器、废料容器、产物收集容器和/或输入产物容器。63.如权利要求56至62中任一项所述的方法，其中：该至少一个容器包含含有所述病毒载体颗粒及所述细胞的至少一个输入容器、废料容器、产物容器及至少一个稀释剂容器，其各通过该一系列管线及该至少一个开口连接至该空腔。64.如权利要求63所述的方法，其中该方法还包括在该孵育之前和/或期间，实现该输入组合物引入至该空腔中，该引入包括液体从该至少一个输入容器通过该至少一个开口流入该空腔中。65.如权利要求56至64中任一项所述的方法，其中至少一个容器还包含在该孵育期间的至少一个点之前和/或期间包含气体的容器，和/或该封闭系统还包含能够将气体引入至该离心室的内部空腔中的微生物过滤器和/或该封闭系统含有用于实现气体引入的注射器端口。
66.如权利要求65所述的方法，其中该方法包括在该孵育之前和/或期间，提供或实现气体在无菌条件下引入至该空腔中，该引入通过(a)来自包含气体的容器的气体的流动、(b)来自该封闭系统的外部环境经过该微生物过滤器的气体的流动、或(c)来自连接至该系统的注射器在该注射器端口处的气体的流动来实现。67.如权利要求66所述的方法，其中实现该气体引入至该离心室的内部空腔中与实现该输入组合物引入至该离心室的内部空腔中同时或一起进行。68.如权利要求66或权利要求67所述的方法，其中该输入组合物与气体是在该输入组合物及气体引入至该离心室的内部空腔中之前，于该离心室外面的无菌条件下组合在单一容器中。69.如权利要求68所述的方法，其中实现该气体引入与实现该输入组合物引入至该空腔中同时地或依次地分开进行。70.如权利要求66至69中任一项所述的方法，其中该气体引入是通过允许或引起来自包含该气体的无菌封闭容器、来自外部环境且穿过微生物过滤器或来自包含该气体的注射器的该气体的流动来实现。71.如权利要求24至70中任一项所述的方法，其中该气体为空气。72.如权利要求1至71中任一项所述的方法，其中该孵育为连续过程的一部分，该方法还包括：在该孵育的至少一部分期间，于该离心室旋转期间实现该输入组合物连续引入至该空腔中；及在该孵育的一部分期间，实现液体在该...
【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：朱诺治疗学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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