对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法及其应用技术

本发明专利技术提出了对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法及其应用。该方法包括：(1)选择S期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，其中，所述外源物质包括Cas9蛋白和sgRNA。利用该方法能有效实现对动物胚胎进行电转染并基因编辑。实现对动物胚胎进行电转染并基因编辑。

【技术实现步骤摘要】
对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体的，本专利技术涉及对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法及其应用，更具体的，本专利技术涉及对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法、构建突变受精卵细胞的方法、构建纯合HDR受精卵细胞的方法、构建致死基因单缺失受精卵细胞的方法、构建突变动物的方法以及对动物受精卵进行透明带弱化处理的方法。

技术介绍

[0002]基因工程小鼠在生物学研究中具有重要意义，据《2018年英国活体动物科学程序年度统计》报导的180万例实验程序，60％的程序以小鼠为实验动物；172万例创造和繁育基因工程动物实验程序中，87％的程序是为培育基因工程小鼠。据报道，中国对模拟人类疾病的动物模型需求激增，基因工程小鼠市场需求快速增长，2022年市场需求将突破15.9亿美元。
[0003]基因工程小鼠需求庞大，但目前对小鼠胚胎进行基因编辑的主流技术为显微注射技术，其通量低，效率低，成本高。同时，构建多基因敲除小鼠模型，成本高，周期长，成功率低，严重限制了小鼠模型的应用。
[0004]基于电转染的胚胎基因编辑技术近几年刚刚出现，依然处于研究摸索阶段。因此，现有基于电转染的胚胎基因编辑技术仍有待改进。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种具有能够有效地将基因编辑系统电转染进入动物胚胎，并实现高效同源重组的手段。
[0006]本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：
[0007]专利技术人在研究过程中发现，现有的受精卵细胞基因编辑技术效率不稳定，通常只在一到两个单基因上进行了测试，没有稳定地在不同的基因位点上实现高效率的单基因编辑，没有高效的获取纯合的突变受精卵细胞，而且无法实现多基因编辑，这在很大程度上限制了对应稀缺小鼠模型的应用。本专利技术的专利技术人在深入分析后，意外发现在进行小鼠胚胎电转染时，用于基因编辑的外源基因导入小鼠胚胎的时间节点对于最终的电转染效率至关重要，从而完成了本专利技术提出一种能够高效实现电转染外源物质进入受精卵细胞的方法，进一步可以稳定地在不同的基因位点上实现高效率的基因编辑，而高效地获取重组受精卵细胞，这在很大程度上促进了对应稀缺小鼠模型的应用。
[0008]由此，本专利技术提出了一套高效稳定的动物受精卵细胞(在本文中有时也称为“胚胎”)电转染基因编辑系统，根据本专利技术的实施例，利用该系统能够增加通量、提高基因编辑敲除效率、提高杂合HDR胚胎比例、提高纯合HDR胚胎比例、实现多基因编辑，从而降低基因工程小鼠的培育成本，为高效培育基因工程小鼠奠定良好基础。
[0009]在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种对动物受精卵进行电转染基因编辑的方
法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：(1)对处于S期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，其中，所述外源物质包括Cas9蛋白和sgRNA。
[0010]根据本专利技术的实施例，专利技术人通过大量实验意外地发现，动物受精卵进行电转染基因编辑时，动物受精卵细胞透明带弱化处理及所处的细胞周期阶段对于电转染基因编辑的效率影响至关重要，其中，所述透明带弱化处理是通过使所述动物受精卵细胞与台式液接触4～10秒钟，以Cas9蛋白和sgRNA混合物的方式进行电转染，能够有效地提高基因编辑的效率。
[0011]当采用S期以前的动物受精卵细胞时，以Cas9蛋白和sgRNA混合物的方式进行电转染，能够有效地提高基因编辑的效率。
[0012]本专利技术的专利技术人发现，对于动物胚胎，尤其是小鼠胚胎而言，进行透明带弱化处理，具体的是，将动物胚胎与台式液进行接触，该步骤的处理时间长短对于后续电转染的效率以及得到纯合HDR突变体的效率是至关重要的，如果接触的时间过短，则会造成透明带的弱化程度不足，如果时间过长，则会造成透明带弱化程度过高，会影响胚胎的存活。另外，专利技术人还通过大量实验发现，通过8次脉冲完成电穿孔转染(在本文中“电穿孔转染”与“电转染”可以互换使用)能够有效地提高转染效率，并且维持胚胎的生存活力，尤其是实现多基因的高效率基因编辑。根据本专利技术的实施例，按照上述步骤处理的动物受精卵，其电转染效率明显得到提高。
[0013]在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种构建突变受精卵细胞的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：(1)对处于S期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，其中，所述外源物质包括Cas9蛋白和至少一种sgRNA，基于重量，所述Cas9蛋白与所述至少一种sgRNA重量的比例为2～6：1。
[0014]如前所述，根据本专利技术的实施例，采用S期以前的动物受精卵细胞时，并且以Cas9蛋白和sgRNA混合物的方式进行电转染，能够有效地提高基因编辑的效率，从而可以进一步提高构建突变受精卵细胞的效率。
[0015]在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种构建突变受精卵细胞的方法，所述突变受精卵细胞为纯合HDR受精卵细胞，根据本专利技术的实施例，所述方法包括：(1)对处于S期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，以便获得经过转染的受精卵细胞，其中，所述外源物质包括Cas9蛋白、至少一种sgRNA和至少一种与所述sgRNA对应的ssODN，其中，基于重量，所述Cas9蛋白与所述至少一种sgRNA重量的比例为2～6：1；和(3)从所述经过转染的受精卵细胞中选择所述纯合HDR受精卵细胞。纯合HDR受精卵细胞的比例能够达到20％。
[0016]如前所述，根据本专利技术的实施例，采用S期以前的动物受精卵细胞时，并且以Cas9蛋白和sgRNA混合物的方式进行电转染，能够有效地提高基因编辑的效率，从而可以进一步提高构建突变受精卵细胞的效率。另外意外地发现，纯合HDR受精卵细胞的比例能够达到20％。
[0017]在本专利技术的第四方面，本专利技术提出了一种构建突变受精卵细胞的方法，所述突变受精卵细胞为致死基因单缺失受精卵细胞。根据本专利技术的实施例，所述方法包括(1)对处于
S期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，以便获得经过转染的受精卵细胞，其中，所述外源物质包括Cas9蛋白、至少一种sgRNA和至少一种与所述sgRNA对应的ssODN，其中，基于重量，所述Cas9蛋白与所述至少一种sgRNA重量的比例为2～6：1；和(3)从所述经过转染的受精卵细胞中选择所述致死基因单缺失受精卵细胞，其中，所述至少一种sgRNA和所述ssODN是基于致死基因确定的。
[0018]如前所述，根据本专利技术的实施例，采用S期以前的动物受精卵细胞时，并且以Cas9蛋白和sgRNA混合物的方式进行电转染，能够提高构建突变受精卵细胞的效率。另外根据本专利技术的实施例，意外地发现，在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法，其特征在于，包括：(1)选择S期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，其中，所述外源物质包括Cas9蛋白和sgRNA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物为哺乳动物。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物包括啮齿类动物、犬、猫、兔、猴。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述动物包括小鼠和大鼠。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物受精卵处于G1期。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在受精后10小时内，完成所述电穿孔转染处理。7.根据权利要求1所的方法，其特征在于，所述透明带弱化处理是通过使所述动物受精卵细胞与台式液接触0～40秒钟进行的。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述透明带弱化处理是通过使所述动物受精卵细胞与台式液接触5秒钟进行的。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照重量，所述外源物质中所述Cas9蛋白的用量是sgRNA用量的2～6倍。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照重量，所述外源物质中所述Cas9蛋白的用量是sgRNA用量的4倍。11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源物质包括：至少一种sgRNA，所述至少一种sgRNA分别针对不同的靶点；和至少一种与所述sgRNA对应的ssODN，所述ssODN的序列是基于所述靶点两侧预定长度而确定的。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述外源物质包括2～12种sgRNA。13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，基于10微升的电转染预混液，每种sgRNA的用量为1微克，所述Cas9蛋白的用量为所至少一种sgRNA总量的2～6倍。14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，基于10微升的电转染预混液，所述Cas9蛋白的用量不超过20微克，优选不超过16微克。15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电穿孔转染处理采用5～10次脉冲。16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电穿孔转染处理采用8次脉冲。17.一种构建突变受精卵细胞的方法，其特征在于，包括：(1)对处于S期以前的动物受精卵进行透明带弱化处理；(2)将外源物质与经过透明带弱化处理的动物受精卵混合后，进行电穿孔转染处理，其中，所述外源物质包括Cas9蛋白和至少一种sgRNA，基于重量，所述Cas9蛋白与所述至少一种sgRNA重量的比例为2～6：1。18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述Cas9蛋白与所述至少一种sgRNA重量的比例为4：1。19.一种构建突变受精卵细...

【专利技术属性】
技术研发人员：李寅青，朱明，袁俊松，臧璐，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：