检测淡水鱼类桑提库珀蛙病毒的特异性引物、探针及快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测淡水鱼类桑提库珀蛙病毒的特异性引物、探针及快速检测试剂盒，其中，淡水鱼类桑提库珀蛙病毒荧光定量检测试剂盒包括特异性引物组A和Taqman荧光探针B；本发明专利技术采用荧光定量技术，通过检测淡水鱼类桑提库珀蛙病毒的衣壳蛋白基因，来检测淡水鱼类桑提库珀蛙病毒，这是目前国内外首次研制检测淡水鱼类桑提库珀蛙病毒的引物组和试剂盒。该试剂盒的研制为淡水鱼类桑提库珀蛙病毒病的监测和预防奠定基础。测和预防奠定基础。测和预防奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
检测淡水鱼类桑提库珀蛙病毒的特异性引物、探针及快速检测试剂盒


[0001]本专利技术属于靶DNA片断的快速检测领域，具体地说，涉及一种检测淡 水鱼类桑提库珀蛙病毒的特异性引物、探针及快速检测试剂盒。

技术介绍

[0002]淡水鱼类桑提库珀蛙病毒(Fish Santee
–
Cooper ranavirus，FSCRV) 是引起多种淡水鱼类大量死亡的致病性病毒，常引起大口黑鲈、乌鳢、鳜鱼、 小带刺尾鱼和孔雀鱼发病死亡。其对大口黑鲈的致病力最高，常引起大口黑 鲈体表溃疡，严重的肌肉深层溃烂，急性发病时，体表没有溃烂症状，解剖 病鱼鳃丝出血或发白，少数病鱼肝脏有出血点，并伴有肾脏肿大或出现围心 腔出血。其引起的疾病对大口黑鲈养殖产业危害极大。FSCRV为双链DNA病 毒，属于虹彩病毒科蛙病毒属，该病毒是蛙病毒属下一个独特的病毒种，与 两栖类动物来源的蛙病毒存在较大差异。该病毒于1991年从美国佛罗里达 州野生大口黑鲈中被发现，其造成野生大口黑鲈在养殖期大量死亡，死亡率 一般为30～40％，严重的达到50％以上，近几年造成的经济损失无法估量。 该病毒在国内外未见报道，由于该病毒至今未有检测试剂盒和检测方法，严 重阻碍了该病毒引起疾病的预防工作，因此该病毒检测试剂盒的开发和检测 技术的研究显得尤为重要。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术针对上述问题，提供了一种检测淡水鱼类桑提库珀蛙 病毒的特异性引物、探针及快速检测试剂盒，本专利技术的引物、探针和试剂盒 特异性强，敏感性高，能实现快速、有效且准确检测淡水鱼类桑提库珀蛙病 毒；本专利技术中的试剂盒分别为荧光定量检测试剂盒，该试剂盒在封闭的情况 下判断结果，扩增产物不会对检测环境造成污染，可用于淡水鱼类桑提库珀 蛙病毒病的监测和早期预防。本专利技术采用荧光定量技术，通过检测淡水鱼类 桑提库珀蛙病毒的衣壳蛋白基因，来检测淡水鱼类桑提库珀蛙病毒，这是目 前国内外首次研制检测淡水鱼类桑提库珀蛙病毒的试剂盒；该试剂盒的研制 为淡水鱼类桑提库珀蛙病毒病的监测和预防奠定基础。
[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术还公开了一种检测淡水鱼类桑提库珀蛙 病毒的引物探针混合物，其由引物组A和Taqman荧光探针B组成，探针B 的5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团。
[0005]进一步地，引物组A包含引物FSCRV
‑
q102F和引物FSCRV
‑
q102R；
[0006]引物FSCRV
‑
q102F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
[0007]引物FSCRV
‑
q102R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
[0008]探针的B的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0009]进一步地，荧光报告基团选自6
‑
羧基荧光素、六氯
‑6‑
甲基荧光素、VIC 荧光染料、四氯
‑6‑
羧基荧光素、羧基
‑
X
‑
罗丹明、6
‑
羧基四甲基罗丹明、磺 酰罗丹明、6
‑
羧基
‑4’
，5
’‑
二氯
‑2’
，7
’‑
二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、 花菁3、花菁3.5、花菁5和花菁5.5中的一种或几种；所述荧光淬灭基团选 自6
‑
羧基四甲基罗丹明、4
‑
(4
‑
二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、 黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的一种或几种。
[0010]本专利技术还公开了一种淡水鱼类桑提库珀蛙病毒荧光定量检测试剂盒，包 括特异性引物组A和Taqman荧光探针B。
[0011]进一步地，Taqman荧光探针B核苷酸序列5
’
端标记6
‑
FAM，3
’
端标 记BHQ1。
[0012]进一步地，该试剂盒还包括独立包装的病毒裂解液、PCR反应液、阳性 质控品、阴性质控品，其中病毒裂解液为含有10mM Tris、1％SDS、1.0mMEDTA，pH8.0的缓冲液，PCR反应液为探针法荧光定量PCR反应液，阴性 质控品为灭菌生理盐水，阳性质控品是含有淡水鱼类桑提库珀蛙病毒衣壳蛋 白基因的载体。
[0013]本专利技术还公开了一种由上述检测淡水鱼类桑提库珀蛙病毒荧光定量检 测试剂盒在检测淡水鱼类桑提库珀蛙病毒中的应用，包括以下步骤：
[0014]待检样品使用病毒裂解液采用煮沸裂解法提取DNA，分别加入到引物探 针混合液，再加入PCR反应液，混匀后进行荧光定量PCR，反应条件为95℃ 条件下反应5
‑
10分钟；然后95℃反应5
‑
15秒，60℃反应20
‑
45秒，共38
‑
45 个循环；荧光信号收集时设定为FAM，荧光信号收集设在60℃；
[0015]结果判断：如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为淡水鱼类桑提库 珀蛙病毒阴性；如果检测通道出现S型扩增曲线，Ct值≤35，则淡水鱼类 桑提库珀蛙病毒别判定为阳性。
[0016]与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：
[0017]1)采用本专利技术的引物组对淡水鱼类桑提库珀蛙病毒进行检测，因为特 异性高，所以可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否；
[0018]2)本专利技术的快速诊断试剂盒是利用荧光定量技术快速检测淡水鱼类桑 提库珀蛙病毒，检测灵敏度高，扩增模板仅需36.6个病毒拷贝；
[0019]3)本专利技术的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1h即可完成扩增， 且效率高；
[0020]4)本专利技术的快速诊断试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较 低，可建立成本低廉的快速筛选体系，实现现场高通量快速检测；
[0021]8)本专利技术的快速诊断试剂盒不但使得淡水鱼类桑提库珀蛙病毒定性检 测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且该试剂盒是检测淡水鱼类桑提 库珀蛙病毒的第一个试剂盒，填补了淡水鱼类桑提库珀蛙病毒无检测方法的 缺口，具有很高的科研和经济价值。
[0022]当然，实施本专利技术的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技 术效果。
附图说明
[0023]此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部 分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的 不当限定。在附图中：
[0024]图1是本专利技术淡水鱼类桑提库珀蛙病毒荧光定量检测试剂盒特异性检 测图；其中，1：嗜水气单胞菌；2：鲫鱼疱疹病毒病毒；3：鲤鱼浮肿病毒； 4：大口黑鲈动脉炎病毒5：草鱼出血病病毒；6：锦鲤疱疹病毒；7：淡水 鱼类桑提库珀蛙病毒；NTC：正常大口黑鲈DNA阴性
对照；
[0025本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测淡水鱼类桑提库珀蛙病毒的引物探针混合物，其特征在于，其由引物组A和Taqman荧光探针B组成，Taqman荧光探针B的5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的引物探针混合物，其特征在于，所述引物组A包含引物FSCRV
‑
q102F和引物FSCRV
‑
q102R；所述的引物FSCRV
‑
q102F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的引物FSCRV
‑
q102R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述Taqman荧光探针B的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。3.根据权利要求1所述的淡水鱼类桑提库珀蛙病毒荧光定量检测探针B，其特征在于，所述荧光报告基团选自6
‑
羧基荧光素、六氯
‑6‑
甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯
‑6‑
羧基荧光素、羧基
‑
X
‑
罗丹明、6
‑
羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6
‑
羧基
‑4’
，5
’‑
二氯
‑2’
，7
’‑
二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁3.5、花菁5和花菁5.5中的一种或几种；所述荧光淬灭基团选自6
‑
羧基四甲基罗丹明、4
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：潘晓艺，蔺凌云，沈锦玉，巩金鹏，姚嘉赟，尹文林，黄雷，袁雪梅，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：