本发明专利技术公开了一种重组人源IxIII胶原蛋白、表达菌株及其应用。所述的重组人源IxIII胶原蛋白由亲水片段重组人源I型胶原蛋白I 69aa和/或重组人源III型胶原蛋白III 96aa拼接而成。本发明专利技术构建的重组人源IxIII胶原蛋白表达菌株能够有效稳定和大量地表达重组人源IxIII胶原蛋白。本发明专利技术的重组人源IxIII胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其165个氨基酸组成的短肽结构与人胶原蛋白I及人胶原蛋白III中对应的蛋白序列100％相同，应用于人体中不会造成免疫排斥。重组人源IxIII胶原蛋白温和不刺激，能够有效缓解面部红血丝问题，起到舒缓修复的作用，可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。妆品等领域。妆品等领域。
【技术实现步骤摘要】
重组人源IxIII胶原蛋白、表达菌株及其应用
[0001]本专利技术属于生物工程菌
，涉及一种重组人源IxIII胶原蛋白、表达重组人源IxIII胶原蛋白的毕赤酵母工程菌及其应用。
技术介绍
[0002]红血丝主要是因为面部角质层薄弱导致毛细血管位置更容易接触和感知到外界环境变化，从而造成毛细血管扩张而引起的面部现象。患者面部看上去比一般正常人群肤色红，也就是人们常称的高原脸，有的仅仅是两侧颧部发红，边界呈圆形，一般呈丝线状排列。这种皮肤薄而敏感，过冷或过热、情绪激动时脸色更红。严重者还会形成沉积性色斑，难以治愈。
[0003]胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体中含量最多的蛋白质，占到蛋白质总量的25％至35％。它的主要功能体现在维护细胞外环境，维持组织器官的正常生理功能和修复肌体损伤等方面。胶原蛋白是天然的生物资源，具有其它高分子材料无法比拟的优异的生物组织相容性，对细胞的支撑弹性和可降解性。因此，胶原蛋白可以广泛应用在医药和化妆品等行业中。
[0004]然而，天然胶原蛋白无法溶于水，性质不均一，难以被人体利用，往往需要经过化学手段处理后才能使用。此外，当前市场上销售的胶原蛋白产品都是取自猪、牛、鱼等动物组织中，很难避免病毒感染，同时无法与人体相容，会导致免疫排斥和过敏症状。所以，目前的胶原蛋白只能在化妆品和保健品中使用，根本无法发挥胶原蛋白的原本生物学功能。
[0005]为了解决传统动物胶原的问题，许多学者开始着手应用生物技术来生产重组胶原。因微生物培养的种种便利，利用重组微生物生产胶原逐渐成为主流。范代娣等人应用大肠杆菌高密度发酵培养生产的重组类人胶原蛋白，并已成功应用到化妆品领域，实现了产业化生产(中国专利201310157411.7，201510883010.9等)。但是细菌表达体系具有内毒素、热原等生物安全问题，使得产品的生产、检测成本高，并存在安全隐患；表达的蛋白以包涵体形式存在细菌细胞内，产物纯化困难、回收率受限制；另外原核表达系统比较低级，不能完成表达产物的翻译后加工修饰，使产物不具有生物活性。
[0006]因此，越来越多的研究开始利用真核微生物生产重组胶原蛋白。酵母菌具有天然的优势。首先酵母已经在食品、医药化工等行业有着悠久的使用历史，同时可以用于外源蛋白的分泌表达，有利于下游的分离纯化工艺，同时不会像细菌那样存在内毒素及热源等的生物安全性问题。
技术实现思路
[0007]本专利技术通过组合人I型胶原蛋白及人III型胶原蛋白中的短肽，并通过重复此短肽获得高活性的重组人源胶原蛋白，目的在于提供一种亲水性优异的重组人源IxIII型胶原蛋白，以及分泌表达该蛋白的毕赤酵母工程菌及其应用，能高效、安全地进行重组人源IxIII型胶原蛋白的胞外分泌表达。
[0008]实现本专利技术目的的技术方案如下：
[0009]本专利技术的重组人源I型胶原蛋白I 69aa，氨基酸序列如SEQ No.3所示。
[0010]本专利技术的重组人源III型胶原蛋白III 96aa，氨基酸序列如SEQ No.4所示。
[0011]本专利技术的重组人源IxIII胶原蛋白为由重组人源I型胶原蛋白I 69aa和/或重组人源III型胶原蛋白III 96aa拼接而成。具体可以为，若干个重组人源I型胶原蛋白I 69aa首尾连接拼接而成；或若干个重组人源III型胶原蛋白III 96aa首尾连接拼接而成；或重组人源I型胶原蛋白I 69aa和重组人源III型胶原蛋白III 96aa首尾连接拼接而成；或以重组人源I型胶原蛋白I 69aa和重组人源III型胶原蛋白III 96aa首尾连接拼接而成的短肽作为重复单元，重复N次得到的重复短肽，N≥2；或以若干个重组人源I型胶原蛋白I 69aa和若干个重组人源III型胶原蛋白III 96aa首尾连接拼接而成；或以若干个重组人源I型胶原蛋白I 69aa和若干个重组人源III型胶原蛋白III 96aa首尾连接拼接而成的短肽作为重复单元，重复N次得到的重复短肽，N≥2。本专利技术中所述的若干个为≥2。
[0012]在具体实施方式中，本专利技术提供了一种重组人源IxIII胶原蛋白IxIII 165aa，由SEQ NO.3所示的人I型胶原蛋白的短肽序列与SEQ NO.4所示的人III型胶原蛋白的短肽序列首尾相连组成的165氨基酸的短肽，氨基酸序列如SEQ No.5所示。
[0013]在具体实施方式中，本专利技术提供了一种重组人源IxIII胶原蛋白IxIII 495aa，由SEQ NO.3所示的人I型胶原蛋白的短肽序列与SEQ NO.4所示的人III型胶原蛋白的短肽序列首尾相连组成的165氨基酸重复3次得到的重复短肽，氨基酸序列如SEQ No.6所示。其理论分子量约45.049kd。
[0014]本专利技术的重组人源IxIII胶原蛋白IxIII 495aa的编码基因，其核苷酸序列如SEQ No.7所示。
[0015]本专利技术构建的重组人源IxIII胶原蛋白质粒ppic9K-IxIII的核苷酸序列如SEQ No.7所示，通过将重组人源IxIII型胶原蛋白IxIII 495aa的编码基因双酶切连接至ppic9K载体的Xho I和Not I间构建而成。
[0016]本专利技术构建的分泌表达重组人源IxIII型胶原蛋白IxIII 495aa的菌株为巴斯德毕赤酵母PichiapastorisJY0501，保藏编号为CGMCC No.16464，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0501通过将Sac I酶切得到的线性化重组人源IxIII型胶原蛋白质粒ppic9K-IxIII诱导入巴斯德毕赤酵母中构建而成。
[0017]本专利技术还提供上述重组人源IxIII胶原蛋白IxIII 495aa在制备修复红血丝护肤品中的应用。
[0018]优选地，上述修复红血丝护肤品中，所述的重组人源IxIII胶原蛋白IxIII 495aa的浓度为0.2％～0.4％(w/v，g/mL)，优选为0.3％(w/v，g/mL)。
[0019]本专利技术从已知序列的人体胶原蛋白基因I型和III型的螺旋区中选择水溶性、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。本专利技术的重组人源ppic9K型胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥，在生物医用材料、化妆品
等领域具有潜在的应用前景。
附图说明
[0020]图1为人Ⅰ型α1链胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。
[0021]图2为人III型α1链胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。
[0022]图3为重组人源IxIII胶原蛋白IxIII 495aa氨基酸的疏水性分析本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.重组人源III型胶原蛋白III 96aa，氨基酸序列如SEQ No.4所示。2.重组人源IxIII胶原蛋白，其特征在于，为由重组人源I型胶原蛋白I 69aa和/或重组人源III型胶原蛋白III 96aa拼接而成，所述的重组人源I型胶原蛋白I 69aa，氨基酸序列如SEQ No.3所示。3.根据权利要求2所述的重组人源IxIII胶原蛋白，其特征在于，由若干个重组人源I型胶原蛋白I 69aa首尾连接拼接而成；或若干个重组人源III型胶原蛋白III 96aa首尾连接拼接而成；或重组人源I型胶原蛋白I 69aa和重组人源III型胶原蛋白III 96aa首尾连接拼接而成；或以重组人源I型胶原蛋白I 69aa和重组人源III型胶原蛋白III 96aa首尾连接拼接而成的短肽作为重复单元，重复N次得到的重复短肽，N≥2；或以若干个重组人源I型胶原蛋白I 69aa和若干个重组人源III型胶原蛋白III 96aa首尾连接拼接而成；或以若干个重组人源I型胶原蛋白I 69aa和若干个重组人源III型胶原蛋白III 96aa首尾连接拼接而成的短肽作为重复单元，重复N次得到的重复短肽，N≥2。4.根据权利要求2所述的重组人源IxIII胶原蛋白，其特征在于，为重组人源I...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵健烽，徐鹏程，余继刚，高力虎，冯丽萍，黄建民，
申请(专利权)人：江苏江山聚源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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